Humane 3D-Lebersphäroide als Tierversuchsersatzmodelle: Herstellung, Lagerung und Untersuchungen zur Lebertoxizität

Human 3D Liver Spheroids as Replacement Model for Animal Testing: Production, Storage, and Studies on Liver Toxicity

Gabriele Horn^a, Tamara Kranawetvogl^a, Harald John^a, Franz Worek^a, Timo Wille^a

^a Institut für Pharmakologie und Toxikologie der Bundeswehr, München

Zusammenfassung

Hintergrund: Zur Minimierung von Tierversuchen in der Arzneimittelforschung werden aussagekräftige, humane Modelle benötigt. In dieser Studie wurde ein dreidimensionales Lebermodell unter besonderer Berücksichtigung von Herstellung, Lagerung und Bevorratung etabliert und die Fragestellung untersucht, ob die Anwendung des in Deutschland eingeführten Antidots Obidoxim bei Pestizidvergiftungen ein Risiko für die Ausbildung eines Leberschadens darstellt.

Methodik: Lebersphäroide wurden bei 4 °C in Zellkulturmedium und einer Gewebeprotektionslösung für bis zu 72 h gelagert und anschließend in einem Zellkulturmedium wiedererwärmt. Um eine potenzielle Leberschädigung zu untersuchen, wurden die Lebersphäroide gegenüber Oximen (HI-6, MMB-4, Pralidoxim (2-PAM), Obidoxim), Pestiziden (Malathion, Malaoxon) sowie einer Kombination aus Pestiziden und Obidoxim exponiert. Die metabolische Aktivität der Lebersphäroide und bekannte Leberschädigungsparameter wurden bestimmt. Diclofenac diente als positive, leberschädigende Kontrollsubstanz.

Ergebnisse: Die Kaltlagerungin Zellkulturmedium führte zu einem vollständigen Verlust der metabolischen Aktivität der Lebersphäroide. Die metabolische Aktivität der Lebersphäroide blieb nach Lagerung in der Gewebeprotektionslösung erhalten(93 ± 6 % nach 48 h, bzw. 86 ± 4 % nach 72 h). Die Lebertoxizität der einzelnen Oxime und Pestizide war gering, jedoch kam es nach Exposition gegenüber Malaoxon in Gegenwart von 1 000 µM Obidoxim für 72 h zu einer ausgeprägten Abnahme der metabolischen Aktivität und einer erhöhten Freisetzung des Leberschädigungsparameters AST.

Schlussfolgerung: Die Kaltlagerung von Lebersphäroiden bei 4 °C kann mit einer kommerziell verfügbaren Gewebeprotektionslösung stark verbessert werden. Die Lebertoxizität der getesteten Oxime ist bei klinisch relevanten Konzentrationen als vernachlässigbar anzusehen. Die vorliegenden Ergebnisse liefern keinen Hinweis darauf, dass Leberschäden unter fachgerechter Anwendung von Oximen bei Pestizidvergiftungen vermehrt auftreten. Lediglich die Verwendung von stark supratherapeutischen Oximkonzentrationen könnte zu einer Schädigung der Leber beitragen. Aus dieser Studie lassen sich keine entgegengesetzten Therapieempfehlungen für die bisherige Antidottherapie bei Organophosphatvergiftungen ableiten.

Schlüsselwörter: Lebersphäroide, Kaltlagerung, Oxime, Organophosphate

Summary

Background: Reliable, human simulation models are required to reduce the number of animal experiments. In this study, a three-dimensional liver model was established with a specific focus on production, storage and stockage. The potential risk of liver damage after treatment with obidoxime, an antidote introduced in Germany for pesticide poisoning, was investigated.

Methods: Hypothermic storage of liver spheroids was assessed at 4 °C in cell culture medium or a tissue preservation solution up to 72h with subsequent rewarming in culture medium. To study potential hepatotoxicity, liver spheroids were exposed to oximes (HI-6, MMB-4, pralidoxime (2-PAM), obidoxime), pesticides (malathion, malaoxon) and a combination of pesticides with obidoxime. Metabolic activity of liver spheroids and known parameters of liver damage were determined. Diclofenac was used as positive hepatotoxic control.

Results: Cold storage in standard culture medium resulted in a complete loss of metabolic activity whereas the tissue preservation solution maintained metabolic activity (93 ± 6 % after 48 h, 86 ± 4 % after 72 h). All individually tested oximes and pesticides showed a negligible effect on liver spheroids. The exposure to malaoxon in the presence of 1,000 µM obidoxime resulted in a marked decrease of metabolic activity after 72 h and an increased release of liver damage parameter AST.

Conclusion: Cold storage can be optimized with a commercially available tissue preservation solution. Liver toxicity of the individual oximes at clinically relevant concentrations can be considered as negligible. The present study provides no evidence that oximes, if applied properly, contribute to impaired liver function after pesticide poisoning. Liver damage may be provoked only if highly supratherapeutic oxime concentrations are used. Changes in the current therapy recommendations of pesticide poisoning cannot be derived from this study.

Key words: Liver spheroids, cold storage, oximes, organophosphorus compounds

Einleitung

Das Institut für Pharmakologie und Toxikologie der Bundeswehr (InstPharmToxBw) beschäftigt sich mit Fragestellungen des medizinischen C-Schutzes. Dies setzt die Etablierung aussagekräftiger Organmodelle voraus. Dabei muss auf Tierschutz, Übertragbarkeit auf humanes Gewebe (Speziesunterschiede) sowie das tatsächliche Widerspiegeln der Organsituation (3D-Modell vs. 2D-Zellkultur) geachtet werden. Die Leber ist zentral für den Arzneimetabolismus und gilt als Hauptorgan für die Manifestation arzneimittelbedingter Nebenwirkungen. Am InstPharmToxBw wurden Lebersphäroide etabliert, die aus zwei verschiedenen humanen Zelltypen, HepaRG-Zellen und primären hepatischen Sternzellen, bestehen [3][27]. HepaRG-Zellen stammen von einer immortalisierten Zelllinie, die viele Merkmale von Leberzellen behält und bereits in Studien über Arzneimitteltoxizität und -metabolismus verwendet wurde [1][31]. Hepatische Sternzellen dienen in der Leber als Vitamin-A-Speicher und steuern die Regeneration sowie den bindegewebigen Umbau. Zunächst wurden Methoden zur Lagerung und Bevorratung der Lebersphäroide optimiert.

Seit den 1950er Jahren existieren teils widersprüchliche Berichte von Leberschäden nach Vergiftungen mit phosphororganischen Verbindungen [2][13][28], zu denen Pestizide und Nervenkampfstoffe zählen. Die Störung der Leberfunktion wurde teilweise mit Oximen, die als Antidote bei Vergiftungen mit phosphororganischen Verbindungen eingesetzt wurden, in unmittelbaren Zusammenhang gebracht [2][9][12][16]. Dagegen konnte in Tierstudien [5][6], Studien an freiwilligen Versuchspersonen [4] oder Fallberichten [8][20] keine Leberschädigung nach Oximgabe beobachtet werden. Die arzneimittelinduzierte Lebertoxizität wurde mit Lebersphäroiden in der vorliegenden Studie zuerst mit einer bekannten lebertoxischen Substanz, dem Schmerzmittel Diclofenac [7][17], untersucht. Anschließend erfolgte die Exposition der Lebersphäroide gegenüber Oximen (HI-6, MMB-4, Pralidoxim (2-PAM), Obidoxim), Pestiziden (Malathion, Malaoxon) sowie Pestiziden in Kombination mit einer klinisch relevanten (10 µM Obidoxim) und einer supratherapeutischen Oximkonzentration (1.000 µM Obidoxim). Die Viabilität der Lebersphäroide, die ein Maß für den Anteil lebender Zellen in einer Zellpopulation ist, die Freisetzung bekannter Leberschädigungsparameter (Aspartat-Aminotransferase (AST) und Alanin-Aminotransferase (ALT)) sowie von Albumin, einem Protein, das von Leberzellen gebildet wird, wurden analysiert.

Methoden

Herstellung der Lebersphäroide

Humane Lebersphäroide wurden aus differenzierten HepaRG-Zellen und hepatischen Sternzellen (HSteC) hergestellt [27]. Aus einer Zellsuspension mit 480 000 HepaRG/mL und 20 000 HSteC/mL wurden je 50 µL pro Well einer 384-Well Ultra-low-attachment Platte pipettiert. Hierin formten sich kompakte Sphäroide nach Inkubation (37 °C, 5 % CO₂) über drei Nächte.

Immunhistochemische Studie der Lebersphäroide

Für mikroskopische Aufnahmen wurden die Lebersphäroide optisch geklärt [19][25], um ihre Struktur zu erhalten und ein Schneiden der Sphäroide zu vermeiden. 4’,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) wurde zur Zellkernfärbung verwendet. Die gleichmäßige Verteilung von HepaRG-Zellen und HSteC in den Sphäroiden kann anhand des Nachweises der Expression von Proteinen, zum Beispiel Vimentin bei HSteC und Zytokeratin 8/18 bei HepaRG-Zellen gezeigt werden.

Kaltlagerung der Lebersphäroide und anschließende Wiedererwärmung

Lebersphäroide wurden bei 4 °C in Zellkulturmedium oder einer speziell entwickelten Gewebeprotektionslösung für 24 h, 48 h oder 72 h gelagert [29]. Die Viabilität der Lebersphäroide wurde nach 3 h Wiedererwärmung in Zellkulturmedium (37 °C) gemessen. Als Kontrolle wurde die Viabilität von Lebersphäroiden verwendet, die bei 37 °C in Zellkulturmedium kultiviert wurden. Der Viabilitätstest basierte auf der Quantifizierung von Adenosintriphosphat (ATP), dem Energieträger in metabolisch aktiven Zellen.

Bestimmung der Viabilität nach Exposition gegenüber Diclofenac, Oximen und Pestiziden

Lebersphäroide wurden gegenüber 50 µM – 2 000 µM Diclofenac und Lösungsmittelkontrolle exponiert. Nach 5 h, 24 h, 48 h und 72 h wurde die Viabilität der Lebersphäroide gemessen. Weiterhin wurden Lebersphäroide jeweils gegenüber 10 µM – 2 000 µM Oximen (HI-6, MMB-4, 2-PAM, Obidoxim) und Pestiziden (Malathion, Malaoxon) exponiert, sowie gegenüber 10 µM – 2 000 µM Malathion oder Malaoxon in Gegenwart von Obidoxim (10 µM oder 1 000 µM). Die Bestimmung der Viabilität erfolgte nach 24 h, 48 h, 72 h und 96 h. Aus den Messungen der Viabilität wurden die effektiven Konzentrationen (EC₅₀) ermittelt, die ein Maß für die halbmaximale Schädigung darstellen. Dies ermöglichte den Vergleich der verschiedenen Substanzen. Ein niedriger Wert deutete auf eine höhere Toxizität hin.

Bestimmung von Albumin und Leberschädigungsparametern AST, ALT in Überständen

In Zellkulturüberständen wurden die Parameter AST und ALT gemessen, die bei Leberschädigung vermehrt freigesetzt werden. Eine veränderte Albuminsekretion aus Leberzellen nach Exposition gegenüber leberschädigenden Substanzen kann ebenfalls durch Analyse der ­Zellkulturüberstände festgestellt werden. Die Lebersphäroide wurden gegenüber je drei verschiedenen Konzentrationen von Diclofenac (500 µM, 1 000 µM, 2 000 µM), Oximen, Pestiziden (je 100 µM, 1 000 µM, 2 000 µM), sowie Malathion und Malaoxon (100 µM, 1 000 µM, 2 000 µM) in Kombination mit Obidoxim (10 µM oder 1 000 µM), exponiert. Die Zellkulturüberstände wurden nach 24 h-96 h gesammelt. Die Bestimmung von AST, ALT sowie Albumin erfolgte mittels human Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA).

Stabilität der Oxime HI-6, MMB-4, 2-PAM und Obidoxim in Zellkulturmedium

Die Stabilität der Oxime HI-6, MMB-4, 2-PAM und Obidoxim (je 100 µM oder 2 000 µM) wurde nach Inkubation im Zellkulturmedium bei 37 °C und 5 % CO₂ nach 4 h, 24 h, 48 h, 72 h und 96 h mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) mit Diodenarray-Detektor bestimmt [15]. Dadurch konnte abgeschätzt werden, ob die Lebersphäroide kontinuierlich gegenüber Oximen exponiert werden.

Datenanalyse

Die Datenanalyse erfolgte mit RStudio (Version 4.0.3, 2020–10–10). Die Ergebnisse der Bestimmung von AST, ALT und Albumin mittels ELISA sind in Tukey boxplots dargestellt. AST, ALT und Albumin aus exponierten Sphäroiden wurden mit den Kontrollen anhand des Wilcoxon-Rangsummen-Test verglichen. p-Werte < 0.05 wurden als statistisch signifikant erachtet.

Ergebnisse und Diskussion

Immunhistochemische Studie der Lebersphäroide

Anhand der Proteinexpression von Vimentin in HSteC und Zytokeratin 8/18 in HepaRG-Zellen konnte die gleichmäßige Verteilung von HepaRG-Zellen und HSteC in Lebersphäroiden sowie die Expression charakteristischer Marker nachgewiesen werden (Abbildung 1).

Kaltlagerung und Wiedererwärmung der Lebersphäroide

Die hier getestete, kommerziell verfügbare Gewebeprotektionslösung wurde entwickelt, um die kalte Lagerung von Blutgefäßen zu verbessern. Sie enthält hohe Konzentrationen der Kationen Natrium und Kalium sowie Eisenchelatoren, um die kälteinduzierte Schädigung von Endothelzellen zu verringern [23][24][29]. Es konnte gezeigt werden, dass die Gewebeprotektionslösung gut dazu geeignet ist, um die Viabilität der Lebersphäroide nach Kaltlagerung über bis zu 72 h und anschließender Wiedererwärmung in Zellkulturmedium (37 °C) stabil zu halten (93 ± 6 % nach 48 h, bzw. 86 ± 4 % nach 72 h). Die kalte Lagerung von Lebersphäroiden in Zellkulturmedium war keine Alternative zur Gewebeprotektionslösung, da es bereits nach 24 h zu einem vollständigen Verlust der Viabilität sowie morphologischen Veränderungen der Lebersphäroide kam.

Diclofenac-induzierte Hepatotoxizität

Diclofenac ist ein häufig verschriebenes Arzneimittel und wird beispielsweise zur Behandlung von Schmerzen und Arthritis eingesetzt. Die Einnahme kann zu hepatischer Dysfunktion führen [18][21]. In dieser Studie wurde Diclo­fenac als positive hepatotoxische Kontrolle verwendet, um die Leberschädigung an Lebersphäroiden zu untersuchen. Die effektiven Konzentrationen (EC₅₀) nach ­Exposition gegenüber Diclofenac sind in Tabelle 1 dargestellt. Die Abnahme der EC₅₀ im Verlauf der Expositionsdauer weist auf eine zunehmende Toxizität hin. Andere in-vitro Untersuchungen haben ähnliche Werte ergeben. Beispielweise wurde nach 24-stündiger Diclofenac-Exposition von HepaRG-Sphäroiden ein EC₅₀-Wert von 0,82 mM bestimmt [22], der gut mit den Ergebnissen der vorliegenden Studie übereinstimmt (EC₅₀ = 0,79 mM, Tabelle 1). Die hepatotoxische Wirkung von Diclofenac spiegelte sich auch in der erhöhten Freisetzung von AST, ALT und einer erniedrigten Sekretion von Albumin aus Lebersphäroiden wider (Daten nicht gezeigt).

Exposition von Lebersphäroiden gegenüber Oximen und Pestiziden

Klinisch relevante Oxim-Plasmakonzentrationen liegen nach intramuskulärer Administration einer einzelnen Autoinjektordosis von 220 mg Obidoxim, 600 mg 2-PAM oder 500 mg HI-6 im Bereich von 40 µM Obidoxim, 50 µM 2-PAM oder 50 µM HI-6 [28][30]. Nach Injektion der Tagesdosis von Obidoxim, 2-PAM oder HI-6 würden die Plasmakonzentrationen stets unter 200 µM liegen. In der vorliegenden Studie wurden Lebersphäroide gegenüber Oximkonzentrationen von 10 µM bis 2 000 µM exponiert, um die Auswirkungen klinisch relevanter wie auch supratherapeutischer Oximkonzentrationen zu untersuchen. Nach Exposition der Lebersphäroide gegenüber HI-6, MMB-4, 2-PAM und Obidoxim konnte zu keinem Zeitpunkt eine relevante Abnahme der Viabilität festgestellt werden. Die Exposition gegenüber Malathion allein oder in Kombination mit 10 µM oder 1 000 µM Obidoxim hatte keine Auswirkung auf die Viabilität der Lebersphäroide. Erst nach Exposition gegenüber 10 µM–2 000 µM Mala­oxon in Kombination mit 1 000 µM Obidoxim kam es zu einem ausgeprägten Verlust von Viabilität (Tabelle 1).

Die Leberschädigungsparameter AST, ALT und die Albuminsekretion wurden in Zellkulturüberständen gemessen. Bei den Oximen HI-6, 2-PAM sowie bei Malathion allein und in Kombination mit Obidoxim ergaben sich keine wesentlichen Änderungen der Leberschädigungsparameter. Die erhöhte Freisetzung von AST und ALT aus Lebersphäroiden nach Exposition gegenüber supratherapeutischen Konzentrationen von MMB-4 ist in Abbildung 2 dargestellt. Bei Obidoxim konnte lediglich ein Anstieg von ALT nach einer Expositionsdauer von 96 h bei einer Konzentration von 2 000 µM festgestellt werden (Daten nicht gezeigt). Die Exposition gegenüber Malaoxon allein oder in Kombination mit Obidoxim führte zu einer erhöhten AST-Freisetzung bei hohen Pestizidkonzentrationen (Abbildung 3). Es konnte keine signifikante Änderung der ALT-Werte festgestellt werden. Die Albuminsekretion war einzig nach Exposition gegenüber 2 000 µM Malaoxon in Kombination mit 1 000 µM Obidoxim nach 96 h signifikant reduziert (p < 0.05 vs. Kontrolle, Daten nicht gezeigt).

Die Studie gibt einen Hinweis darauf, dass nur die Verwendung von supratherapeutischen Oximdosen bei Vergiftungen mit phosphororganischen Verbindungen zu einer Leberschädigung beitragen könnte (Abbildungen 2 und 3). Die nach Exposition der Sphäroide gegenüber einer Kombination aus Malaoxon und 1 000 µM Obidoxim festgestellte erhöhte Toxizität war insgesamt jedoch geringer als bei Diclofenac (Tabelle 1). Aus dieser Studie lassen sich keine Empfehlungen für Änderungen der bisherigen, etablierten Therapie bei Vergiftungen mit phosphororganischen Verbindungen [28] ableiten.

Stabilität der Oxime HI-6, MMB-4, Obidoxim und Pralidoxim in Zellkulturmedium

Bei der Interpretation der Ergebnisse muss die Stabilität der verwendeten Oxime im Zellkulturmedium berücksichtigt werden. Obidoxim war im Zellkulturmedium stabil (residuelle Konzentration von 100 % nach 96 h bei 100 µM Obidoxim) und es konnte von einer kontinuierlichen Exposition der Lebersphäroide ausgegangen werden. HI-6 dagegen war durch geringe Stabilität in wässrigen Lösungen [10][11] bereits nach 48 h nicht mehr zu detektieren. Die Oxime MMB-4 und 2-PAM unterlagen einem deutlichen Abbau, der bei MMB-4 ausgeprägter war (residuelle Konzentrationen von 76 % nach 72 h bei 100 µM 2-PAM vs. 10 % nach 72 h bei 100 µM MMB-4). Bei physiologischem pH (pH 7,4) unterliegen die Oxime einem nicht-enzymatischen Abbau [11][14][26]. Die entstehenden Abbauprodukte und deren Toxizität lagen nicht im Fokus dieser Studie. Die Auswirkungen der Abbauprodukte auf die Viabilität können jedoch als vernachlässigbar angesehen werden, da die Viabilität der Lebersphäroide während der Versuchsdauer mit Oximen stabil war.

Take Home Messages

Lebersphäroide können in einer kommerziell verfügbaren Gewebeprotektionslösung bei 4 °C gelagert werden. Nach anschließender Wiedererwärmung im Zellkulturmedium kann die Viabilität der Sphäroide auf einem stabilen Niveau gehalten werden. Somit ist die Kaltlagerung eine geeignete Methode zur Lagerung der Lebersphäroide während eines Transportes.

Die Toxizität der Oxime HI-6, MMB-4, 2-PAM, Obidoxim und des Pestizides Malathion gegenüber Lebersphäroiden ist bei Konzentrationen bis zu 2 mM als gering anzusehen. Nur der Einsatz von massiv supratherapeutischen Oximkonzentrationen bei Vergiftungen mit phosphororganischen Verbindungen kann zu einer hepatischen Dysfunktion beitragen. Änderungen für die bisherigen Therapieempfehlungen bei Vergiftungen mit phosphororganischen Verbindungen ergeben sich hieraus nicht.

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Manuskriptdaten

Zitierweise

Horn G, Kranawetvogl T, John H, Worek F, Wille T: Humane 3D-Lebersphäroide als Tierversuchsersatzmodelle: Herstellung, Lagerung und Untersuchungen zur Lebertoxizität. WMM 2023; 67(3): 87-92.

DOI: https://doi.org/10.48701/opus4-104

Für die Verfasser

Oberfeldarzt Prof. Dr. Timo Wille

Institut für Pharmakologie und Toxikologie der Bundeswehr

Neuherbergstr. 11, 80937 München

E-Mail: timowille@bundeswehr.org">timowille@bundeswehr.org

Manuscript Data

Citation

Horn G, Kranawetvogl T, John H, Worek F, Wille T: [Human 3D liver spheroids as replacement model for animal testing: production, storage, and studies on liver toxicity]. WMM 2023; 67(3): 87-92.

DOI: https://doi.org/10.48701/opus4-104

For the authors

Lieutenant Colonel (MC) Prof. Dr. Timo Wille

Bundeswehr Institute for Pharmocology and Tocicology

Neuherbergstr. 11, D-80937 Munich

E-Mail: timowille@bundeswehr.org

WMM 2023 – 67(3)