Affenpockendiagnostik am Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr – am Puls der Zeit

Monkeypox Virus State-of-the-Art Diagnostics at the Bundeswehr Institute of Microbiology

Rosina Ehmann^a, Sabine Zange^a, Roman Wölfel^a, Joachim J. Bugert^a

^a Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr, München

Zusammenfassung

Ausbrüche neuartiger oder bei uns sonst nicht heimischer, sich aber stetig ausbreitender Erreger sind ein fester Bestandteil unserer globalisierten und eng vernetzten Welt geworden. Nach der SARS-CoV-2-Pandemie haben die Affenpocken 2022 bewiesen, dass sich nicht nur neuartige, agile, kleine RNA-Viren in Windeseile auf dem gesamten Erdball ausbreiten können, sondern auch eher konservative DNA-Viren, denen man bisher ein sehr festes Verbreitungsgebiet zugeordnet hatte. Die Palette an Erregern, die vom endemischen zum epi- oder pandemischen Ausbruchsgeschehen führen und schwerwiegende Krankheitsbilder verursachen können, ist groß und steigt durch die ständige Entstehung neuartiger Krankheitserreger noch weiter an. Die Überwachung des weltweiten Infektionsgeschehens und die Entwicklung und Anpassung zeitgemäßer Diagnostikverfahren als Vorbereitung oder rasche Antwort auf Ausbruchsgeschehen kann von der Routinediagnostik nicht geleistet werden, sondern ist Aufgabe spezialisierter Nischeninstitute mit besonderem Auftrag, wie es das Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr (IMB) als Ressortforschungseinrichtung des Bundes ist. Nachfolgend wird dargestellt, wie das IMB auf den Affenpockenausbruch vorbereitet war und wie die Diagnostik bedarfsorientiert abläuft.

Schlüsselwörter: Affenpockenvirus, Surveillance, hochpathogene Nischenerreger, Stufendiagnostik, PCR, Anzucht

Summary

Novel and emerging viruses have integrated themselves firmly into our globalized world. After the SARS-CoV-2 pandemic monkeypox virus has proven that not only novel and quickly mutating RNA viruses can rapidly spread around the globe and cause pandemics but also a rather conservative DNA virus that was thought to have a relatively small and fix area of distribution. The panel of highly pathogenic microorganisms that have the potential to turn from locally endemic to epidemic or pandemic agents is quite extensive and even larger when the constant evolution of novel novel microorganisms is taken into account. Only highly specialized institutions with a distinct mission like the Bundeswehr Institute of Microbiology (IMB) can tackle the broad spectrum of constant monitoring of infectious disease processes worldwide and the development of state-of-the-art diagnostics for expected and unexpected pathogens of high consequnece. The following essay is a short description of the preparedness and activities in poxviral diagnostics and research of the IMB and an outlook on future activities.

Keywords: monkeypox virus, emerging viruses, highly pathogenic microorganisms, PCR, virus isolation, surveillance

Einführung

Der weltweite Affenpocken-(Mpox-) Ausbruch 2022 war in vielen Aspekten überraschend und hat deutlich unterstrichen, wie wichtig es ist, auch auf Nischenerreger diagnostisch adäquat vorbereitet zu sein. Was im Mai 2022 noch mit einigen wenigen Fallberichten begann, weitete sich schnell auf eine bisher nie gesehene Anzahl von diagnostischen Meldungen außerhalb Afrikas aus. Im Januar 2023 meldete die WHO weit über 84 000 bestätigte Fälle aus 110 Ländern, davon allein über 3 600 Fälle in Deutschland (siehe auch <https://worldhealthorg.shinyapps.io/mpx_global/>).

Einordnung des Virus

Das Affenpockenvirus (monkeypox virus, MPXV) gehört zur Gattung der Orthopocken und verursacht eine virale Erkrankung, die ursprünglich nur auf dem afrikanischen Kontinent beheimatet war. Affenpocken gehen klassischerweise mit einem bläschenbildenden Hautausschlag einher, der später verkrustet. Als zusätzliche Symptome können geschwollene Lymphknoten, Kopf- und Gliederschmerzen und ein reduziertes Allgemeinbefinden auftreten [8]. Die Virulenz verschiedener Affenpockenstämme variiert abhängig von der phylogenetischen Zugehörigkeit. Während früher die zentralafrikanischen Stämme mit einer ausgeprägteren Klinik den milderen westafrikanischen Stämmen gegenübergestellt wurden, unterscheidet man inzwischen zwei Hauptkladen mit vielen unterschiedlichen Subtypen [3] (siehe <https://www.who.int/news/item/12–08–2022-monkeypox--experts-give-virus-variants-new-names>). Allen Affenpockenstämmen gemein ist jedoch, dass das klinische Bild deutlich milder als bei den heute ausgerotteten Pocken (verursacht durch das Variolavirus) abläuft und tödliche Verläufe bei entsprechender medizinischer Versorgung äußerst selten vorkommen. Im aktuellen Ausbruchsgeschehen wurden nur 80 Todesfälle bei über 84 000 bestätigten Erkrankten gemeldet (< 0,1 %).

Affenpocken 2022 und davor

Ein überraschendes Element des laufenden Ausbruchs war der schnelle Anstieg von Fallzahlen fast simultan in vielen verschiedenen Ländern. Noch bis vor fünf Jahren waren die Affenpocken nur in Afrika bekannt; dort vornehmlich im Kongo und in Nigeria. Außerhalb Afrikas traten sie nur im Zusammenhang mit exportierten Primaten oder anderen empfänglichen Säugetieren auf. Ein solcher Ausbruch in einer experimentellen Primatenhaltung in Dänemark im Jahr 1958 führte zur Entdeckung und Erstbeschreibung des Virus [2]. Auch in Deutschland gab es einen Ausbruch am Primatenzentrum in Göttingen im Jahr 2006. Vorher kam es 2003 in den USA zu einem größeren Ausbruchsgeschehen bei Menschen, verursacht durch infizierte exotische Kleinsäuger aus Afrika, die als Haustiere verkauft wurden [9]. Über die Infektion von heimischen Präriehunden kam es ebenfalls zu Übertragungen auf den Menschen. Affenpocken als regelmäßig, aber dennoch vereinzelt auftretende, reiseassoziierte Erkrankung beim Menschen wurden erst 2018 bekannt. Zwei voneinander unabhängige Fälle in Großbritannien im September 2018 erlangten große mediale Aufmerksamkeit. Erstmals waren in Europa Affenpockenfälle beim Menschen aufgetreten. Die Indexpatienten waren nigerianische Staatsbürger auf Familienbesuch. Während der Hospitalisation kam es zudem zu einem Übertragungsfall beim Pflegepersonal [1]. Seitdem wurden jährlich sporadische Einzelfälle berichtet, unter anderem auch aus Israel, Singapur und den USA.

Wie war Deutschland auf den Ausbruch 2022 vorbereitet?

Aufgrund der fehlenden Relevanz für die Routinediagnostik ist der Nachweis von Affenpocken eine Nische für spezialisierte Laboratorien. Da die Affenpocken als anzeigepflichtige Tierseuche gelistet sind, hält das Friedrich-Löffler-Institut ein diagnostisches Portfolio vor. Als oberstes Organ der öffentlichen Gesundheitsüberwachung ist das Robert Koch-Institut ebenfalls mit der Affenpockendiagnostik betraut. Daneben existieren spezialisierte Einrichtungen wie das Bernhard-Nocht-Institut für Tropenmedizin, die über diagnostische Kapazitäten in diesem Bereich verfügen. Als kompetenter Partner im medizinischen B-Schutz hat das Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr (IMB) bereits 2020 mit der schnellen SARS-CoV-2-Diagnostik bewiesen, welche Fähigkeiten es auf diesem Gebiet hat. Die Pockendiagnostik ist seit Jahrzehnten eine Kernkompetenz des medizinischen B-Schutzes und der Nachweis sowie die sichere Differenzierung verschiedener Pockenspezies sind fester Bestandteil des Portfolios des IMB. Nur wenige Tage nach den ersten Berichten von Affenpockenfällen aus Großbritannien und Portugal im Mai 2022, trafen auch am IMB erste Proben zur Untersuchung auf MPXV auf. So gelang der Nachweis des deutschen Mpox-Indexpatienten am IMB [7].

Diagnostische Nachweismöglichkeiten am IMB

PCR-Nachweis

Für die reine Bestätigung eines klinischen Verdachtsfalls ist der PCR-Nachweis von MPXV-Nukleinsäure ausreichend und verbindet elegant diagnostische Schnelligkeit und Genauigkeit. PCR-Verfahren mit unterschiedlichen Zielregionen erlauben zusätzlich die Differenzierung auf verschiedenen Ebenen, so z. B. die Zuordnung auf Gattungsebene zu den Orthopocken, auf Speziesebene zu den Affenpocken oder auf Stammebene zu verschiedenen phylogenetischen Kladen (westafrikanisch/zentralafrikanisch). In einer geschickten Stufendiagnostik können je nach gewünschter Fragestellung PCR-Verfahren kombiniert werden, um ein effizientes Screening mit einer präzisen Bestätigung zu verknüpfen.

Am IMB werden Mpox-Verdachtsproben zunächst einer generischen Orthopocken-PCR unterzogen. Positive Proben werden dann spezifisch auf Affenpocken getestet (Abbildung 1). Proben, die zwar orthopocken-positiv sind, jedoch in der MPXV-PCR negativ bleiben, werden in einem kleinen Teilbereich des Genoms sequenziert, um die Art zuzuordnen. Abseits vom aktuellen Mpox-Ausbruchsgeschehen sind in Deutschland die meisten Pockenerkrankungen auf Kuhpocken (CPXV) zurückzuführen, aber auch Vacciniavirusfälle (VACV) können selten auftreten.

Erregerisolierung

Neben der PCR-Diagnostik kommt im Fall ungewöhnlicher Ausbruchsereignisse der Isolation des Erregers eine große Bedeutung zu. Einerseits besitzt die Anzucht des Virus aus Patientenproben noch einmal größere diagnostische Aussagekraft, wird aber aufgrund des Ressourcen- und Zeitaufwands nur selten praktiziert. Im Fall der Affenpocken kommt auch der hohe Anspruch an die Sicherheitsvoraussetzungen dazu, da MPXV nur in Laboratorien der Sicherheitsstufe 3 isoliert und vermehrt werden darf. Andererseits ist es essenziell, ein Isolat zu besitzen, um die biologischen Eigenschaften des Ausbruchsstammes näher untersuchen zu können. Im aktuellen Ausbruchsgeschehen wurde Affenpockenvirus aus Material des Münchner Indexpatienten auf Affennierenepithelzellen isoliert (Abbildung 2) [7]. Wachstumseigenschaften und Verhalten des Virus in verschiedenen Zelllinien sowie die Empfindlichkeit auf therapeutische Wirkstoffe lassen sich nur mit einem Isolat näher untersuchen. Die Analyse antigenetischer Charakteristika und die Bestimmung der Vollgenomsequenz verlaufen mit Isolaten deutlich einfacher als mit Virusmaterial aus Patientenproben.

Genomsequenzierung

Die Genomsequenzierung ist äußerst aufwändig und besitzt für die Routinediagnostik wenig Bedeutung, findet durch die technologische Entwicklung im Rahmen der SARS-CoV-2-Diagnostik aber trotzdem immer breitere Anwendung. Am IMB werden gezielt verschiedene Isolate gesammelt und mit Vollgenomsequenz in der Stammsammlung des Instituts hinterlegt, um die Biologie der Erreger besser zu verstehen und effiziente Diagnostik zu ermöglichen sowie Prophylaxe- und Therapiekonzepte erarbeiten zu können [4].

Serologische Diagnostikverfahren

Abschließend verfügt das IMB auch über serologische Diagnostikverfahren. Der Nachweis von Antikörpern gegen Pocken ist aber vor allem im wissenschaftlichen Bereich von Interesse. Beim Patienten erschwert die hohe Kreuzreaktivität verschiedener Pockenspezies gegeneinander und das mögliche Vorhandensein alter Impfantikörper die direkte Aussagekraft. Antikörper können im Krankheitsverlauf und aus mehreren sequenziellen Proben jedoch genutzt werden, um akute Infektionen retrospektiv zu bestätigen oder antigenetische Unterschiede zu untersuchen. Der Nachweis neutralisierender Antikörper wird ebenfalls vorrangig im wissenschaftlichen Kontext genutzt.

Das Auftreten von Mutationen und ihre Auswirkung auf die Diagnostik

Im Juli 2022 wurden in den USA über drei Fälle von Affenpockenvarianten berichtet, die in einer weit verbreiteten PCR-Methode des Center for Disease Control and Prevention (CDC) falsch negativ ausfielen, weil die Zielregion der PCR im Genom dieser Stämme teilweise oder vollständig deletiert war [5][6]. Ähnlich wie bei Coronaviren verändern sich auch Pockenviren über die Zeit. Allerdings treten diese Veränderungen mit deutlich niedrigerer Geschwindigkeit auf als bei SARS-CoV-2 oder Influenzavirus, da die Pockenviren zu den genetisch stabileren DNA-Viren zählen. Dennoch können durch Deletionen immer wieder Teilbereiche des Genoms verschwinden, da Pockenviren im Vergleich zu den meisten anderen Viren ein sehr großes Genom besitzen und auf Teilbereiche verzichten können, ohne ihre Überlebensfähigkeit zu verlieren. Um Proben dennoch im dynamischen Entstehen neuer Varianten eindeutig bestimmen zu können, ist die Stufendiagnostik, wie sie am IMB verwendet wird, unabdingbar. Der Ausfall mehrerer Zielregionen auf einmal ist deutlich unwahrscheinlicher und Proben mit klarem klinischem Verdacht, aber inkonklusiven diagnostischen Ergebnissen können in der Sequenzierung oder durch Einsatz zusätzlicher speziesspezifischer PCR-Verfahren abschließend aufgeklärt werden.

Nach dem Bekanntwerden der Deletionsmutanten in den USA riefen weltweit verschiedene Labornetzwerke und Überwachungsbehörden dazu auf, besonders auf solche Varianten zu achten und sie zu melden. Bisher beobachtete man bei diesen Varianten kein Verdrängungsverhalten wie bei SARS-CoV-2. In Europa konnte bisher keine dieser Deletionsvarianten nachgewiesen werden.

Ausblick und Fazit

Das IMB ist eine Ressortforschungseinrichtung des Bundesministeriums der Verteidigung für den medizinischen B-Schutz und im Rahmen seines Auftrags für die Diagnostik gefährlicher und seltener Krankheitserreger zuständig. Dazu gehören sowohl das Vorhalten dem Stand der Technik entsprechender Diagnostik zum Nachweis bekannter Krankheitserreger als auch die ständige Beobachtung des epidemiologischen Geschehens, um neu auftretende Erreger oder einschneidende Veränderungen in der Verbreitung oder dem Wirtsspektrum bekannter Erreger frühzeitig zu entdecken. Im Fall der Affenpocken ist das IMB für die Diagnostik bestehender und neuer Virusvarianten und zur Erfüllung des wissenschaftlichen Auftrags gut aufgestellt. Hier beobachtet das Institut die Genomvielfalt, um diagnostische Verfahren ständig weiter anzupassen und auch für die Epidemiologie relevante Genomänderungen frühzeitig zu erkennen. Eine wichtige Fragestellung bleibt auch die Frage nach der Erschließung neuer Reservoirwirte durch MPXV hier in Deutschland sowie die Erforschung neuer antiviraler Wirkstoffe mit breitem Wirkungsspektrum. Durch die Vernetzung mit veterinärdiagnostischen Untersuchungsstellen und einer breiten Basis von Probeneinsendern und wissenschaftlichen Kooperationspartnern leistet das Institut im Rahmen seines Auftrags hier wichtige Grundlagenforschung im Bereich der Pockenvirologie.

Fazit

Nicht nur neuartige Erreger können Pandemien mit weitreichenden Konsequenzen auslösen, sondern auch scheinbar „alte Bekannte“. Da man in seiner Breite nicht auf alle möglichen Erreger vorbereitet sein kann, ist es äußerst wichtig, auf der Basis des aktuellen Infektionsgeschehens immer wieder neu zu bewerten, was prioritär behandelt werden muss. Gleichzeitig müssen Kapazitäten vorhanden sein, um flexibel auf unerwartete Erreger oder Ausbrüche vorbereitet zu sein. Zudem ist jeder Krankheitserreger grundsätzlich in der Lage, sich zu verändern, sodass ein konstantes Monitoring der Stammvielfalt wichtig ist, um etwaige diagnostische Lücken frühzeitig zu entdecken. Ein breit aufgestelltes und mehrstufiges Diagnostikprozedere erlaubt eine bedarfsorientierte Diagnostik und ist auch die Grundlage für erfolgreiche Forschung und Entwicklung von Interven­tionsstrategien.

Literatur

1. Adler H, Gould S, Hine P et al.: Clinical features and management of human monkeypox: a retrospective observational study in the UK. Lancet Infect Dis. 2022; 22(8): 1153-1162. mehr lesen
2. Arita I, Henderson DA: Smallpox and monkeypox in non-human primates. Bull World Health Organ 1968; 39: 277–283 mehr lesen
3. Chen N, Li G, Liszewski MK et al: Virulence differences between monkeypox virus isolates from West Africa and the Congo basin. Virology 2005; 340: 46–63. mehr lesen
4. De Baetselier I, Van Dijck C, Kenyon C et al.: Retrospective detection of asymptomatic monkeypox virus infections among male sexual health clinic attendees in Belgium. Nat Med 2022; 28(11): 2288-2292. mehr lesen
5. Garrigues JM, Hemarajata P, Lucero B et al.: Identification of Human Monkeypox Virus Genome Deletions That Impact Diagnostic Assays. J Clin Microbiol 2022; 60(12): e0165522. mehr lesen
6. Gigante CM, Plumb M, Ruprecht A et al.: Genomic deletions and rearrangements in monkeypox virus from the 2022 outbreak, USA. Genomics 2022 (preprint). , letzter Aufruf 17. Januar 2023. 
7. Noe S, Zange S, Seilmaier M, Antwerpen MH, Fenzl T, Schneider J, Spinner CD, Bugert JJ, Wendtner CM, Wölfel R: Clinical and virological features of first human monkeypox cases in Germany. Infection 2022; 11: 1–6. mehr lesen
8. Petersen E, Kantele A, Koopmans M et al.: Human Monkeypox: Epidemiologic and Clinical Characteristics, Diagnosis, and Prevention. Infect Dis Clin North Am 2019; 33(4): 1027–1043. mehr lesen
9. Reed KD, Melski JW, Graham MBet al.: The detection of monkeypox in humans in the Western Hemisphere. N Engl J Med 2004; 350(4): 342-350. mehr lesen

Manuskriptdaten

Zitierweise

Ehmann R, Zange S, Wölfel R, Bugert JJ: Affenpockendiagnostik am IMB am Puls der Zeit. WMM 2023; 67(3): 72–75

DOI: https://doi.org/10.48701/opus4–102

Für die Verfasser

Oberstabsveterinär Dr. Rosina Ehmann

Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr

Neuherbergstr. 11, 80937 München

E-Mail: rosinaehmann@bundeswehr.org

Manuscript Data

Citation

Ehmann R, Zange S, Wölfel R, Bugert JJ: [State-of-the-Art Monkeypox Virus Diagnostics at the Bundeswehr Institute of Microbiology]. WMM 2023; 67(3): 72–75

DOI: https://doi.org/10.48701/opus4–102

For the authors

Major (VC) Dr. Rosina Ehmann

Bundeswehr Institute of Microbiology

Neuherbergstr. 11, 80937 München

E-Mail: rosinaehmann@bundeswehr.org