Umfassende Ausbruchsaufklärung eines Milzbrandfalles von 2021 in Oberbayern

In-depth Outbreak Investigation of an Anthrax Case in Upper Bavaria, Germany, in 2021

Peter Braun^a, Markus Antwerpen^a, Gregor Grass^a

^aInstitut für Mikrobiologie der Bundeswehr, München

Zusammenfassung

Milzbrand (Anthrax) ist eine Zoonose, die durch das Endosporen-bildende Bakterium Bacillus anthracis verursacht wird. Milzbrand ist in Deutschland sehr selten. In Bayern trat der letzte Fall im Juli 2009 bei Kühen auf. Nach einer langen Ruhephase brach die Krankheit im August 2021 erneut aus und führte zum Tod einer trächtigen Kuh. Bemerkenswerterweise betrafen beide Ausbrüche dieselbe Weide, was auf einen direkten epidemiologischen Zusammenhang schließen lässt. B. anthracis konnte aus Blutkulturen angezüchtet und durch PCR bestätigt werden. Außerdem ermöglichten kürzlich entwickelte diagnostische Teste, die auf Rezeptor-Bindeproteinen aus Bakteriophagen basieren, den schnellen Nachweis von B. anthracis-Zellen direkt in klinischen Proben. Das Genom des isolierten B. anthracis-Stammes mit der Bezeichnung BF-5 wurde einer DNA-Sequenzierung unterzogen und phylogenetisch in eine für europäische B. anthracis-Stämme typische Verwandtschafts-Gruppe (B.Br.CNEVA) eingeordnet. Das BF-5 Genom war nahezu identisch mit dem des Isolats BF-1 aus dem Jahr 2009. Außerdem wurde B. anthracis in Bodenproben an Stellen nachgewiesen, an denen die Kuh auf der Weide verstorben war. Auch für diese Bodenproben lieferten die neuentwickelten diagnostischen Teste den mikroskopischen Nachweis und ermöglichten sogar die direkte Isolierung von B. anthracis.

Schlüsselwörter: Milzbrand, Bacillus anthracis, Ausbruchsaufklärung, Phylogenie, Nachweis-Teste

Summary

Anthrax is a zoonotic diseasae caused by the endospore-forming bacterium Bacillus anthracis. The disease is very rare in Germany. In Bavaria, the last case occurred in cows in July 2009. After a long dormant period, the disease now broke out again in August 2021, killing a pregnant cow. Remarkably, both outbreaks affected the same pasture, suggesting a close epidemiological link. B. anthracis could be cultured from blood cultures and confirmed by PCR. In addition, recently developed diagnostic assays based on receptor-binding proteins from bacteriophages allowed rapid detection of B. anthracis cells directly in clinical samples. The genome of the isolated B. anthracis strain, designated BF-5, was subjected to DNA sequencing and it was phylogenetically classified into a phylogenetic group typical for European B. anthracis strains (B.Br.CNEVA). The BF-5 genome was nearly identical to that of isolate BF-1 from 2009. In addition, B. anthracis was detected in soil samples at sites where the cow had died. For these soil samples, the newly developed diagnostic tests also provided microscopic detection and even allowed for direct isolation of B. anthracis.

Keywords: Anthrax, Bacillus anthracis, outbreak investigation, phylogeny, detection assays

Einleitung

Bacillus anthracis, der Erreger des Milzbrands (auch Anthrax genannt), überdauert in Form von Endosporen im Boden. Diese Sporen können z. B. nach starken Regenfällen[1] oder durch Grabungsarbeiten an alten Tiergräbern [2] wieder an die Oberfläche gelangen. Der Milzbranderreger ist daher berüchtigt dafür, dass er auch nach Jahren oder Jahrzehnten scheinbarer Inaktivität an früheren Ausbruchsorten unerwartet wieder auftaucht [1]. In der Regel infizieren sich dann anfällige Weidetiere, indem sie beim Äsen mit Sporen kontaminierte Erde aufnehmen. Zu solchen Fällen gehören Ausbrüche in Schweden [2], Sibirien [3] oder Italien [4][5]. In Deutschland ist Milzbrand sehr selten. Die letzten Infektionen beim Menschen im Jahr 2012 wurden mit dem illegalen Drogenkonsum von Heroin, das mutmaßlich mit B. anthracis-Sporen kontaminiert war, in Verbindung gebracht [6–8]. Fälle bei Tieren sind ebenso selten, wobei kleinere Ausbrüche bei Rindern in den Jahren 2009 [9], 2012 [10] und 2014 [11] verzeichnet wurden. Während es sich bei diesen Fällen von Rindermilzbrand um Infektionen mit in Deutschland üblichen B. anthracis-Genotypen handelte, gaben die mit Heroinkonsum assoziierten Fälle beim Menschen Anlass zur Sorge, da es sich dabei um Genotypen handelte, die sich von allen bekannten mitteleuropäischen Isolaten unterschieden, aber eng mit Stämmen aus dem Nahen und Mittleren Osten verwandt sind [12]. Wahrscheinlich wurden die Sporen dieses Genotyps durch den Drogenhandel aufgrund kontaminierter Nebenprodukte auf dem Transportweg eingeschleppt [6][12]. Die rasche Identifizierung und Genotypisierung neuer Ausbruchsisolate ist daher wichtig, um natürliche, wiederkehrende Ausbrüche heimischer Stämme von einer absichtlichen Freisetzung des Erregers oder der zufälligen Kontamination durch Einschleppung zu unterscheiden.

Folglich war das Auftreten von Rindermilzbrand im August 2021 zunächst alarmierend. Dieser Ausbruch betraf jedoch denselben Bauernhof, der schon im Jahr 2009 betroffen war. Damals waren vier Färsen der Krankheit erlegen, eine weitere wurde eingeschläfert [13]. Im Jahr 2021 verendete zunächst eine trächtige Kuh mit starkem Verdacht auf Milzbrand.

Das Genom (BF-1) des Milzbrand-Ausbruchs von 2009 wurde durch das Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr (IMB) veröffentlicht [9]. Dieses Genom ist eng verwandt mit anderen Isolaten der B-Gruppe (genauer: B.Br.CNEVA) innerhalb der weltweiten Phylogenie von B. anthracis [14]. Der Genotyp B.Br.CNEVA scheint typisch für Gebirgsregionen in Mitteleuropa von Frankreich [14] bis zur Slowakei [14] und von Schweden [2] bis zur Schweiz [15] zu sein.

In diesem Bericht beschreiben wir die Untersuchung eines nach 12 Jahren erneut aufgetretenen Milzbrandausbruchs in Südbayern. Der rasche Nachweis von B. anthracis im Zusammenhang mit Milzbrandausbrüchen mittels artspezifischer Identifizierungsmethoden ist für die Einleitung von Gegenmaßnahmen zur Infektionskontrolle von größter Bedeutung. Eine zusätzliche genomische Analyse des Erregers kann helfen, zwischen einer natürlichen Infektion und einer absichtlichen Freisetzung des Erregers zu unterscheiden. Ziel dieser Studie war daher die eindeutige Identifizierung von B. anthracis mithilfe einer Reihe diagnostischer Tests, die auf die Nukleinsäuren und Oberflächenstrukturen des Milzbranderregers abzielen. Aufgrund der räumlichen Nähe der Ausbrüche 2009/2021 stellte sich die Frage, ob die beteiligten B. anthracis-Stämme identisch oder unterschiedlich sind. Wir haben daher die Genomsequenz des Isolats aus dem Ausbruch von 2021 analysiert und konnten daraus Rückschlüsse auf die phylogenetischen ­Beziehungen dieses B. anthracis-Stammes mit eng verwandten Stämmen ziehen. Eine vollständige Aus­bruchuntersuchung in Zusammenarbeit mit den Kooperationspartnern Wolfgang Beyer (Universität Hohenheim, Stuttgart), Julia M. Riehm und Matthias Hanczaruk (LGL¹, Oberschleißheim), Jacqueline Oesterheld (IMB), sowie Christian Otterbein (Landratsamt Rosenheim) ist unter [16] beschrieben.

Material und Methoden

B. anthracis- und B. cereus-Stämme wurden wie in [17] angezogen und wie in [18] chemisch inaktiviert. Blutproben wurden wie in [16] inaktiviert. Aus dem linken Nasenloch des Rinderkadavers wurden Blutproben entnommen und zur weiteren Analyse an das LGL und das Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr verbracht. Die Proben wurden auf Columbia-Blutagar kultiviert. Eine einzelne Kolonie mit typischer Wachstumsmorphologie wurde angezüchtet, als BF-5 bezeichnet und für die Genotypisierung und Genom-Sequenzierung verwendet. Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde für chromosomale Marker und beide Virulenz-Plasmid-Marker (pXO1 und pXO2) durchgeführt [5][19]. Für den mikroskopischen Nachweis von B. anthracis aus Blutproben wurde das Rezeptor-Bindeprotein (RBP)-Derivat RBP_{λ03Δ1–120} (im weiteren als RBP oder RBP-Reporter abgekürzt) verwendet. Dazu wurde inaktiviertes Blut mit dem fluoreszierenden mCherry-RBP-Reporter gemischt [18] und fluoreszenzmikroskopisch wie in [18] beschrieben untersucht. Am 6. September 2021 wurden an vier Stellen Bodenproben entnommen, die dem Kopf- und Schwanzbereich entsprachen, wo die infizierte Kuh verendet war und anschließend deren sporenverseuchtes Blut die Weide kontaminiert hatte. Da es in dem Gebiet zwischenzeitlich stark geregnet hatte (> 50 l/m²), wurden die Proben aus einer Tiefe von ca. 10 cm unter der Oberfläche entnommen. Die Bodenproben wurden für die PCR-Analyse wie in [5][19] beschrieben verarbeitet. Zur Anreicherung von B. anthracis aus möglicherweise mit Sporen kontaminierten Bodenproben wurde ein neu entwickeltes magnetisches Trennungsverfahren angewandt. Bei diesem Ansatz wurde das RBP [18] zum Abfangen von B. anthracis aus dem Boden umfunktioniert. Dazu wurde das RBP chemisch an magnetische Partikel (Dyna­beads™) gekoppelt. Der Boden wurde wie in [17] beschrieben verarbeitet und der resultierende Überstand mit Wachstumsmedium gemischt und inkubiert, damit die Sporen auskeimen und sich zu vegetativen Zellen entwickeln konnten. Diese Kultur wurde mit den mit RBP-Reportern beladenen magnetischen Partikeln gemischt und inkubiert, um die B. anthracis-Zellen von der Flüssigkeit zu trennen. Die Abtrennung erfolgte mit Hilfe eines Magnetständers und die Partikel wurden gewaschen sowie auf festes Wachstumsmedium ausplattiert. Blutproben vom Kadaver oder B. anthracis-verdächtige Kolonien nach Anreicherung aus Bodenproben wurden einem kolorimetrischen Enzyme-Linked Phage Receptor Binding Protein Assay (ELPRA) unterzogen wie in [20] beschrieben. Die Nanopore-Sequenzierung wurde auf dem GridION-System (Oxford Nanopore Technologies, Oxford, UK) durchgeführt. Alle im Rahmen dieser Studie erzeugten Daten sind in der NCBI Sequence Read ­Archive (SRA) Datenbank (Bioproject PRJNA171093) öffentlich zugänglich. Aus dem neuen Datensatz und zusätzlichen Genomen aus öffentlichen Datenbanken wurden Einzelnukleotid (SNP) Positionen identifiziert und diese zur Berechnung eines Maximum-Likelihood-Verwandtschaftsbaumes verwendet [21][22].

Ergebnisse

Nachweis von B. anthracis

Eine B. anthracis-Infektion bei einer verendeten Kuh wurde durch initiale in-situ- und PCR-Diagnostik nachgewiesen und durch den Erregernachweis direkt in Blutproben durch neue RBP-Reporter bestätigt.

Die tierärztliche Untersuchung einer verendeten, trächtigen Kuh auf einer Weide in der Nähe von Rosenheim (Bayern, Deutschland) am 24. August 2021 ergab den Verdacht auf eine Milzbrand-Infektion aufgrund krankheitstypischer Symptome, d. h. plötzlicher Tod und blutiger Ausfluss aus allen Körperöffnungen, einschließlich Nasenlöchern, Augen, Vagina und Anus (Abbildungen 1A und 1B). Die PCR von aus Kolonien mit typischer Morphologie isolierter DNA, die nach der Kultivierung von Blut des verendeten Tieres gewachsen waren, ergab positive Ergebnisse für diagnostische PCR-Marker für B. anthracis. Somit wurde die Milzbranderkrankung bestätigt und ein amtlicher Diagnosebericht erstellt.

Abb. 1: In situ-Darstellung einer zwei Jahre alten, trächtigen Kuh, die im August 2021 auf einer Weide in Südbayern an Milzbrand verendete: Nahaufnahme des Kopfes mit blutigem Ausfluss aus den Augen und dem linken Nasenloch (A) und Ansicht des Hinterteils mit blutigem Anus und Vagina (B). Abbildung von Braun et al. 2022 Lizenziert unter Creative Commons Attribution 4.0 International License CC BY-SA 2.0.

Unabhängig von der ersten diagnostischen PCR-Analyse durch die staatlichen Gesundheitsbehörden wurde vom Tierkörper entnommenes Blut (Abbildung 1A) inaktiviert und einem kürzlich entwickelten, auf RBP aus Phagen basierenden Schnellnachweis-Test [20] unterzogen. Die positiven ELPRA Ergebnisse bestätigten die vorherigen PCR-Teste (Abbildung 2A). Mitttels Fluoreszenzmikroskopie wurde festgestellt, dass der fluoreszierende mCherry-RBP-Reporter spezifisch an die Bakterienketten in der Blutprobe band (Abbildung 2B, rote Fluoreszenz). Dies deutete darauf hin, dass es sich bei diesen Bakterien höchstwahrscheinlich um B. anthracis handelte. Bemerkenswert hierbei ist, dass diese Teste auf Grundlage von Phagen-RBP in nur wenigen Minuten durchgeführt werden können.

Abb. 2: Direktnachweis von B. anthracis-Zellen im Blut der verendeten Kuh. A: Mit Meerrettichperoxidase (HRP) konjugiertes RBP wurde direkt zu inaktiviertem Blut (aus dem linken Nasenloch des Tierkadavers, rechtes Reaktionsröhrchen) sowie zu inaktiviertem Schafsblut, das als Negativkontrolle diente (linkes Reaktionsröhrchen), gegeben. Nach dem Waschen wurde chromogenes HRP-Substrat zugegeben und nach einer Minute die blaue Farbentwicklung fotodokumentiert. B: Rekombinantes Fusionsprotein mCherry-RBP wurde zu Blut gegeben und direkt der Fluoreszenzmikroskopie unterzogen. Abgebildet sind überlagerte Bilder von Durchlicht und Fluoreszenzlicht. Maßstabsleisten: 5 µm. Abbildung von Braun et al. 2022 Lizenziert unter Creative Commons Attribution 4.0 International License CC BY-SA 2.0. Bild zugeschnitten.

Phylogenetische Differenzierung

Die B. anthracis-Stämme BF-1 und BF-5 sind klonale, sehr eng verwandte Ausbruchsstämme und gruppieren phylogenetisch mit Stämmen aus dem österreichischen Bundesland Tirol.

Der kanonische Einzelnukleotid-Polymorphismus (canSNP)-Typ von B. anthracis BF-5 wurde bestimmt und der B.Br.CNEVA-canSNP-Gruppe [23] zugeordnet. ­Zusätzlich wurde seine genomische DNA einer Sequenzierung unterzogen (Datenbanknummern CP089993-CP089995). Der Vergleich der Genome der B. anthracis-­Stämme BF-1 (von 2009) und BF-5 (von 2021) ergab, dass sich beide Stämme außerordentlich ähnlich sind. Das Chromosom von BF-5 wies nur drei SNPs und zwei Single Nucleotide Repeat (SNR) Unterschiede auf (beide SNRs in nicht kodierenden Regionen mit Deletionen eines einzelnen „T“). Während das Plasmid pXO1 identisch war, wies pXO2 eine einzige zusätzliche SNP- und ­Single Nucleotide Repeat-Insertion („T“) in drei identischen Wiederholungsregionen auf. Diese Klonalität der beiden Ausbruchsstämme stützt eindeutig die Hypothese, dass vor Ort eine bisher nicht lokalisierte Quelle unbekannten Ursprungs der B. anthracis-Kontamination existiert. Diese Quelle ist höchstwahrscheinlich die Ursache für die wiederholten Milzbrand-Infektionen grasender Kühe auf dieser Weide.

Die Chromosomensequenzanalyse ergab die phylogenetische Einordnung des Stammes BF-5 in ein Cluster mitteleuropäischer B. anthracis-Stämme innerhalb der B.Br.CNEVA-Gruppe. Wie erwartet, war der engste Verwandte der Stamm BF-1 (Abbildung 3). Weitere nahe Verwandte waren die Isolate Tyrol 4675 und Tyrol 6282 aus dem österreichischen Bundesland Tirol von 1988 bzw. 1979. Stämme aus einem großen französischen B.Br.CNEVA-Cluster (nur drei Vertreter in Abbildung 3 dargestellt) sowie Stämme aus der Schweiz, der Slowakei, Deutschland und Italien waren etwas weiter entfernte Verwandte. Bedeutungsvoll ist die gemeinsame Verzweigung (Polytomie) an der Basis des französischen Clusters, der Gruppe mit den Stämmen A016/17OD930 und Tyrol 3520 und der Gruppe mit BF-1, BF-5 sowie Tyrol 4674 und Tyrol 6282 (Abbildung 3). Dies deutet eindeutig auf einen gemeinsamen Vorfahren all dieser Stämme im mitteleuropäischen Raum hin.

Abb. 3: Phylogenie des neuen B. anthracis-Isolats BF-5 und seiner nahen Verwandten aus der kanonischen SNP-Gruppe B.Br.CNEVA: Gezeigt ist ein phylogenetischer Baum von Vertretern der canSNP-Gruppe B.Br.CNEVA von B. anthracis. Der Baum basiert auf 1558 chromosomalen SNPs, die zur Konstruktion eines Maximum-Likelihood-Baums verwendet wurden (Bootstrap-Vertrauenswerte wurden generiert aus 500 Permutationen, und der Baum mit der höchsten Wahrscheinlichkeit ist dargestellt). Isolat-Namen und Herkunftsländer sind an den Endpunkten der Zweige angegeben (rot: in dieser Studie sequenziert; schwarz: Sequenzen aus öffentlichen Datenbanken). Abbildung von Braun et al. 2022 Lizenziert unter Creative Commons Attribution 4.0 International License CC BY-SA 2.0; Bild zugeschnitten und Text aus dem Englischen ins Deutsche übersetzt.

Direkter Nachweis in Bodenproben

Neuartige Phagen-RBP-Reporterfusionen ermöglichen den direkten Nachweis und die Isolierung von B. anthracis aus Bodenproben.

Bodenproben wurden am Fundort in der Nähe von Kopf und Anus des Kadavers der verendeten Kuh entnommen (Abbildungen 1A und 1B). Um die möglicherweise kontaminierten Bodenproben auf B. anthracis einfach zu untersuchen, wurde fluoreszierender mCherry-RBP-Reporter zu den mit Wachstumsmedium vorinkubierten Bodenproben gegeben und die Proben fluoreszenzmikroskopisch untersucht. Mit dieser Methode konnten Zellen von B. anthracis direkt in den Bodenproben nachgewiesen werden, da die Zellketten nach Bindung des RBP-Reporters eine starke rote Fluoreszenz ausstrahlten (Abbildung 4A). Nachdem das Vorhandensein von B. anthracis durch Fluoreszenzmikroskopie angezeigt wurde, erfolgte die Isolierung von B. anthracis aus Bodenproben mit Hilfe magnetischer Partikel, die mit RBP gekoppelt waren und an B. anthracis-Zellen banden (Abbildung 4B, linkes Feld). Ein repräsentatives Ergebnis der Erreger-Isolation ist nach Bebrütung in Abb. 4B (rechtes Feld) dargestellt. Verdächtige B. anthracis-Kolonien, die keine Hämolyse aufwiesen, wurden durch ELPRA und PCR bestätigt (Abbildung 4C). Der neuartige, auf Phagenproteinen basierende magnetische Anreicherungsansatz für B. anthracis schnitt daher sehr gut ab und kann sogar in wesentlich kürzerer Zeit durchgeführt werden als etablierte Methoden.

Abb. 4: Direkter Nachweis und Isolierung von B. anthracis aus kontaminierten Bodenproben vom Fundort der verendeten Kuh. A: Das rekombinante Fusionsprotein mCherry-RBP wurde Bodenproben zugesetzt und der Fluoreszenzmikroskopie (rot) unterzogen. B: Magnetische Partikel mit gekoppeltem RBP wurden zu Bodenproben gegeben, um B. anthracis-Zellen einzufangen. Eine Teil-Probe wurde für die Hellfeldmikroskopie entnommen (linkes Foto) und der Rest der Suspension aus magnetischen Partikeln und Bakterien wurde auf Agar-Wachstumsmedium bebrütet (rechtes Foto). Pfeile zeigen verdächtige Kolonien an. C: Schnelltest auf Basis des RBP-Reporters mit inaktiviertem, verdächtigem Koloniematerial aus diesen Anreicherungskulturen (Positivkontrolle (+) B. anthracis Sterne; Negativkontrolle (-) B. cereus ATCC10987). Blaue Farbentwicklung wurde nach einer Minute fotodokumentiert. Maßstabsleisten: 5 µm. Abbildung von Braun et al. 2022 Lizenziert unter Creative Commons Attribution 4.0 International License CC BY-SA 2.0.

Diskussion

Riskobewertung

Was die Risikobewertung angeht, so hat das erneute Auftreten eines Milzbrandausbruchs nach 12 Jahren [9] auf derselben Weide den Verdacht auf eine absichtliche Freisetzung des Erregers als Ursache entkräftet. Umgekehrt deutete der Ausbruch stark darauf hin, dass ein alter Milzbrandherd noch aktiv war. Dies erinnert an ähnliche Situationen in anderen Regionen Europas. So kam es beispielsweise in Schweden 2011 in einem Naturschutzgebiet zu einem Ausbruch bei Rindern. Aufzeichnungen wiesen darauf hin, dass sich in diesem Gebiet ein alter Standort für die Tierkörperbeseitigung (von Mitte der 1940er Jahre) befand [2][24].

Die vollständige Inaktivierung von B. anthracis-Sporen aus dem Boden innerhalb eines natürlichen Herdes kann bisher durch keine Dekontaminationsmaßnahme gewährleistet werden [25]. Daher sieht das deutsche Recht² neben Dekontaminationsversuchen auch die vorübergehende Sperrung entsprechender Flächen für die Beweidung vor, um eine Reinfektion zu verhindern [25]. Ähnlich wie im vorliegenden Fall deutete die Genomsequenzierung der beiden schwedischen Ausbruchsisolate von 2011/2013 darauf hin, dass diese klonal waren [2]. Als plausible Erklärung für die genomische Identität zwischen räumlich und zeitlich getrennten Ausbrüchen nannten die Autoren die Verbreitung von Sporen durch Vögel oder Wildtiere. Obwohl die schwedischen Ausbrüche die Öffentlichkeit wegen des Risikos einer Umweltkontamination alarmiert haben [2], wurden seither keine weiteren Fälle in dieser Region gemeldet (Stand: 07.November 2022). Aktiver ist das Infektionsgeschehen in Italien, wo Milzbrand in der südlichen Region Basilikata wiederholt auftritt [26][27] und die Böden an den Ausbruchsorten viele Jahre lang mit lebensfähigen Sporen kontaminiert bleiben [4][5].

Phylogenie

Die Phylogenie der B. anthracis canSNP-Gruppe B.Br.CNEVA ist in Frankreich gut charakterisiert, wo diese phylogenetische Linie in den Regionen Alpen, Pyrenäen, dem Zentralmassiv und Saône-et-Loire dominant und ökologisch etabliert ist [28]. Im Gegensatz zu Frankreich, wo alle B.Br.CNEVA-Stämme monophyletisch sind ([28] und Abbildung 3), ist die Situation in Deutschland und Österreich komplexer. Die Isolate aus diesen Ländern verteilen sich auf mehrere eng miteinander verwandte Linien, die von einer sehr flachen Polytomie abzweigen (Abbildung 3). Dies deutet nicht nur darauf hin, dass die B.Br.CNEVA-Gruppe durch ein einziges Ereignis in Frankreich eingeführt wurde, wie bereits früher vorgeschlagen [28]. Unsere Daten skizzieren einen ähnlichen, aber gestaffelten Prozess der begrenzten Etablierung dieses phylogenetischen Zweigs von B. anthracis in Mitteleuropa. In diesem Modell gab es ein frühes Einschleppungsereignis des Erregers in Italien, der Slowakei und Teilen Deutschlands. Von dort aus ereignete sich wahrscheinlich wiederum ein einziges Verschleppungsereignis (der Ursprung der Polytomie), wodurch die heutigen B.Br.CNEVA-Stämme in Frankreich, Österreich, der Schweiz und Bayern verwandtschaftlich eng miteinander verbunden sind (Abbildung 3).

Die Genome der Stämme BF-1 und BF-5 unterscheiden sich nur durch drei chromosomale SNPs. In einer kürzlich durchgeführten Genomstudie zu einem Milzbrandausbruch in Italien wurden Stämme gefunden, die sich um bis zu fünf SNPs unterscheiden [29]. Genomanalysen zur epidemiologischen Untersuchung von Stämmen, die mit Injektionsmilzbrand in Verbindung gebracht werden, haben die Autoren zu der Schlussfolgerung veranlasst, dass die genetische Variation möglicherweise durch die Infektion eines einzigen Wirtes entsteht. Einige phylogenetische Muster lassen sich jedoch am besten durch die genetische Vielfalt erklären, die durch mehrere Infektionszyklen von B. anthracis in verschiedenen Wirten entstanden ist [8]. Der Ausbruch in Bayern im Jahr 2021 scheint diesem Muster zu folgen, da es nur sehr wenige SNP-Unterschiede zwischen den Stämmen desselben Ausbruchsortes im Abstand von 12 Jahren gibt. Bemerkenswert ist, dass alle sechs Isolate, die aus dem Boden rund um den Kadaver und aus einem 80 m entfernten Graben entnommen wurden, dieselben eindeutigen SNP-Positionen aufwiesen wie das Isolat BF-5, das direkt aus dem Blut der verendeten Kuh gewachsen war. Im Gegensatz dazu ist es sehr unwahrscheinlich, dass das Isolat BF-1 ein direkter Vorfahre von BF-5 ist. Der chromosomale SNP 1 unterscheidet sich nur bei BF-5, nicht aber bei BF-1 vom ursprünglich Zustand, wie er bei Ames ‚Ancestor‘ zu finden ist. Umgekehrt zeigen die chromosomalen SNP 2 und SNP 3 in BF-1 einen evolvierten Zustand (relativ zu Ames ‚Ancestor‘), während sie in BF-5 ursprünglich waren.

Ausbruchsprävention

Um das lokale Risiko einer oberflächennahen Sporenkontamination vor Ort akut zu verringern, wurde die betroffene Weide, auf der das Tier verendet war (Abbildung 1A und 1B), mit 10 l/m² 10 % (v/v) Formaldehyd desinfiziert, wie ebenfalls in [1] empfohlen wird. Offensichtlich ist diese Maßnahme weder in der Lage, tiefere Bodenhorizonte zu desinfizieren, noch die nicht identifizierte ursprüngliche Kontaminationsstelle zu beseitigen, die sich vermutlich irgendwo auf dem Gelände befindet. Eine längerfristige Überwachung des oberflächennahen Bodens auf dem Gelände könnte helfen, die Behörden zu alarmieren, falls nach ungünstigen Wetterbedingungen, z. B. starken Regenfällen gefolgt von milden Temperaturen, erneut B. anthracis nachgewiesen werden kann [30]. Weitere methodische Entwicklungen im Zusammenhang mit dem empfindlichen Nachweis von B. anthracis im Boden könnten die Identifizierung und Beseitigung der ursprünglichen Quelle der Sporenkontamination in den betroffenen Örtlichkeiten erleichtern.

Fazit

Bei der Seltenheit von Anthrax-Fällen in Deutschland bot dieser Ausbruch eine ideale Gelegenheit, die im Vorfeld entwickelten Teste zum Nachweis und zur Identifizierung von B. anthracis unter realen Bedingungen zu testen. Dies betrifft zum einen die direkte Mikroskopie von mit B. anthracis infiziertem Blut (Abbildung 2B) oder von ausgekeimten, vegetativen Zellen in mit B. anthracis-Sporen verseuchtem Boden (Abbildung 4A). Ebenso ergaben Schnellteste von inaktiviertem Blut (Abbildung 2B), von mit B. anthracis-Sporen verseuchtem Boden (Abbildung 4B) oder von verdächtigen Kolonien nach Anreicherung (Abbildung 2A) bei diesen authentischen Materialien ähnliche Ergebnisse wie bei zuvor getesteten, künstlich mit Sporen abgeschwächter B. anthracis-Impfstämme versetzten Materialien [20]. Als unvergleichlich gut im Vergleich zu etablierten Methoden hat sich die Anreicherung von B. anthracis mit an magnetische Partikelgekoppelten RBP erwiesen. Diese modernen Nachweismethoden können jedoch nicht nur für die Diagnostik bei natürlichen Milzbrand Ausbrüchen im Inland und in Einsatzgebieten der Bundeswehr eingesetzt werden, sondern auch bei einer absichtlichen Freisetzung des Erregers, z. B. bei einem bioterroristischen Anschlag, und so zu einer schnellen und präzisen Ausbruchsaufklärungen beitragen.

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Manuskriptdaten

Zitierweise

Braun P, Antwerpen M, Grass G: Umfassende Ausbruchsaufklärung eines Milzbrandfalles von 2021 in Oberbayern. WMM 2023: 67(3): 76-82.

DOI: https://doi.org/10.48701/opus4-101

Für die Verfasser

Oberstleutnant Dr. Peter Braun

Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr, Abteilung für Bakteriologie und Toxikologie

80937 München, Neuherbergstr. 11

E-Mail: peter3braun@bundeswehr.org

Manuscript Data

Citation

Braun P, Antwerpen M, Grass G: [In-depth Outbreak Investigation of an Anthrax Case in Upper Bavaria, Germany, in 2021]. WMM 2023: 67(3): 76-82.

DOI: https://doi.org/10.48701/opus4-101

For the authors

Lieutenant Colonel Dr. Peter Braun

Institute für Microbiology der Bundeswehr, Department of Bacteriology and Toxicology

Neuherbergstr. 11, D-80937 München

E-Mail: peter3braun@bundeswehr.org