Die Kardiotoxizität von Oleander – eine unterschätzte Gefahr mit wehrmedizinischer Relevanz?¹

Cardiotoxicity of Oleander – An Underestimated Hazard with Relevance in Military Medicine?

Niko Amend^a, Franz Worek^a, Timo Wille^a

¹ Die Originaldaten zu diesem Beitrag wurden veröffentlicht unter [3].

^a Institut für Pharmakologie und Toxikologie der Bundeswehr, München

Zusammenfassung

Die Kardiotoxizität bei der Vergiftung durch Nerium oleander und Thevetia peruviana ist im südostasiatischen Raum eine relevante Herausforderung für die Gesundheitssysteme. Eine wehrmedizinische Relevanz dieser Vergiftung könnte sich durch die sehr hohe Toxizität bei breiter Verfügbarkeit der Pflanzen und frei publizierten Protokollen zur Extraktion und Aufreinigung kardiotoxischer Inhaltsstoffe ergeben. Die Vergangenheit hat gezeigt, dass toxische Stoffe, die aus Pflanzen stammen, bereits in terroristischer Absicht missbräuchlich verwendet wurden.

Die gegenwärtige Studie untersucht die Kardiotoxizität einiger Hauptvertreter der in Oleander vorhandenen Herzglykoside. Dabei werden aus human induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitete Kardiomyozyten in einem Microelectrode Array System genutzt. Dieses elektrophysiologische Messsystem wird seit vielen Jahren erfolgreich zur Evaluation der Kardiotoxizität von Medikamenten verwendet. Konkret werden sogenannte Feldpotenziale abgeleitet, die vergleichbar mit einem EKG Hinweise auf das arrhythmogene Potenzial von Substanzen geben. Digoxin diente in der aktuellen Studie als bekannte kardiotoxische Referenz. So war es möglich, eine Rangordnung der Einzelsubstanzen hinsichtlich der Kardiotoxizität im Sinne eines Stillstandes der elektrischen Erregung zu erstellen: Neriifolin > Oleandrin > Digitoxigenin = Peruvoside > Digoxin > Thevetin A.

Schlüsselwörter: Kardiotoxizität, Microelectrode Array, iPS, Arrhythmie

Summary

Cardiotoxicity in Nerium oleander and Thevetia peruviana poisoning is a substantial challenge for health care systems in southeast Asia. Relevance in military medicine might arise from the high toxicity and broad availability of Oleander and the availability of protocols for extraction and purification of cardiac glycosides in open literature. Past incidents have shown that plant-derived toxic natural substances might be misused for terrorist purposes.

The current study examines the cardiotoxicity of oleander-derived cardiac glycosides. Therefore, human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes were studied in a microelectrode array system. This electrophysiological tool has been used for many years to study drug-induced cardiotoxicity. In short: Field potentials are obtained since they correlate with an ECG in assessing the arrhythmogenic potential of drugs. In the current study, digoxin was used as a well-characterized cardiotoxic reference compound. Hence it was possible to establish a rank order of these glycosides according to their cardiotoxicity: Neriifolin > Oleandrin > Digitoxigenin = Peruvoside > Digoxin > Thevetin A.

Key Words: cardiotoxicity, microelectrode array, iPS, arrhythmia

Hintergrund

Vergiftungen mit gewöhnlichem (Nerium oleander) (Abbildung. 1) und gelbem Oleander (Thevetia peruviana) stellen die Gesundheitssysteme im südostasiatischen Raum vor erhebliche Herausforderungen. So verursachen suizidale und akzidentielle Vergiftungen schwerste Krankheitsbilder, die das Versterben der Patienten oder langwierige Krankenhausaufenthalte durch die ausgeprägte Kardiotoxizität bedingen können [14].

Hierbei gehören Herzglykoside vom Cardenolid-Typ zu den wesentlichen toxischen Komponenten des Oleanders [25]. Sie zeigen eine Toxizität, die derjenigen des Digoxins ähnelt, indem sie ebenfalls die Na⁺/K⁺-ATPase inhibieren [13]. Durch Hemmung dieses Enzyms kommt es im Herzgewebe zu einem intrazellulären Ca²⁺ und Na⁺-Anstieg bzw. einem extrazellulären K⁺-Anstieg. Dies kann klinisch zu einer Bradykardie und supraventrikulären bzw. ventrikulären Arrhythmien führen [16]. Bei einer akuten Vergiftung zeigen die Patientinnen und Patienten gastrointestinale Symptome (z. B. Erbrechen und Durchfall) und die eingangs beschriebenen Arrhythmien [20].

Lebensbedrohliche Vergiftungen werden mit Aktivkohle, intensivmedizinischen Maßnahmen und der Verabreichung eines Antidots therapiert [14][10]. Dieses Antidot besteht aus Anti-Digoxin Fab-Fragmenten [26]. Obwohl diese Antikörper im klinischen Setting seit vielen Jahren effizient eingesetzt werden, ist deren Verfügbarkeit in Ländern mit niedrigem Einkommen aufgrund des hohen Preises oft nicht gegeben [11].

Über die Toxizität der einzelnen Herzglykoside, die im Oleander enthalten sind, ist wenig bekannt [25]. Tiermodelle zeigen, dass die Toxizität der Herzglykoside stark von der Spezies abhängt. ALSANI et al. berichten von einer tödlichen Dosis von 110 mg Oleanderblätter pro Kilogramm Körpergewicht bei Schafen [4]. Beim Menschen existieren Fallberichte, die von tödlichen Dosen zwischen 5 und 40 Oleanderblättern berichten [19][26]. Deutlich toxischer scheinen die Samen des Oleanders zu sein. Hier werden tödliche Auswirkungen bereits beim Verzehr von ein bis zehn Samen berichtet [20]. Dies erscheint bemerkenswert hinsichtlich des sehr niedrigen Gewichts dieser Samen von ca. 3 mg bei N. oleander. Damit rückt die Toxizität des Oleanders durchaus in die Nähe des hochtoxischen Nervenkampfstoffs VX mit einer geschätzten LD₅₀ von 5 mg/Mensch [1]. In Anbetracht der Tatsache, dass Verkauf und Anbau von Oleander nicht reguliert sind und dass Protokolle zur Aufreinigung der Herzglykoside frei verfügbar sind, ist eine wehrmedizinische Relevanz dieser Vergiftungen in Betracht zu ziehen [23][8][22]. Weiterhin hat die Vergangenheit gezeigt, dass sich Terroristen durchaus pflanzlicher Produkte bedienen, um entsprechende Anschläge zu planen [5].

Um die Kardiotoxizität des Oleanders genauer zu charakterisieren, wurde ein in vitro Modell genutzt. Aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitete Kardiomyozyten (hiPSC-CM) sind seit vielen Jahren ein etablierter Standard in der Untersuchung der Kardiotoxizität verschiedener Pharmaka bzw. toxischer Substanzen [17][18]. Obwohl hiPSC-CM natürlich nur ein Modell des menschlichen Herzens darstellen, werden die dort gewonnenen Erkenntnisse als Surrogat für das arrhythmische Potential entsprechender Substanzen gesehen [7][15]. Ursprünglich wurden diese Modelle entwickelt, um Erregungsrückbildungsstörungen zu untersuchen, die häufig von speziellen Kaliumkanälen (IK_r) verursacht werden [15]. Dieser vom KCNH2 Gen kodierte Kanal ist seither in den Fokus des Interesses gerückt. Somit war es naheliegend, hiPSC-CM in einem Microelectrode Array System zur Untersuchung der Kardiotoxizität des Oleanders zu verwenden.

Abb. 1: Aufnahme von N. oleander (Quelle: N. Amend)

Material und Methoden

Chemikalien

Peruvosid, Neriifolin und Oleandrin wurden von TRC (Toronto, Kanada) und Digitoxigenin und Digoxin von LGC (Wesel, Deutschland) beschafft. Alle anderen Substanzen wurden von Sigma (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland) erworben. Stammlösungen wurden in DMSO hergestellt; die getesteten Konzentrationen reichten von 10 nM bis 1 µM.

Zellkultur

Kryokonservierte hiPSC-CM wurden von Ncardia (Pluricyte, Gosselies, Belgien) erworben und gemäß Herstellervorgaben kultiviert. Dazu wurden Microelectrode Array Chips (60MEA200/30iR-Ti-gr, Multi Channel Systems, Reutlingen, Deutschland) mit 50 µg/ml Fibronektin (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland) beschichtet. Nach dem Auftauen wurden hiPSC-CM mit einer Dichte von 20 000 Zellen/Chip ausgesät. Die Zellen wurden dann bei 37°C in 5 % CO₂/95 % Luft im Brutschrank kultiviert. Ein Mediumwechsel erfolgte am Tag nach der Aussaat und dann jeden zweiten Tag. Nach 24–48 h zeigten sich erste Kontraktionen und nach 3 bis 4 Tagen formten die Zellen einen sich spontan kontrahierenden Zellverbund. Nach 8 bis 10 Tagen stellte sich eine stabile Ruhefrequenz ein und die Chips wurden im Microelectrode Array System verwendet.

Microelectrode Array Messungen

Die Messungen im Microelectrode Array System wurden nach einem bereits etablierten Protokoll durchgeführt [2]. Zusammengefasst wurden die Microelectrode Array Chips in ein MEA-1060 System (Multi Channel Systems) eingebracht, welches über eine integrierte Heizeinheit verfügt. Für die Datenaufzeichnung wurde Cardio 2D Software (Version 2.6.2.0, Multi Channel Systems) verwendet und für die Datenanalyse Cardio 2D + Software (Version 2.4.3.0, Multi Channel Systems). Die Zellen wurden während des Experiments bei 37°C in 5 % CO₂/95 % Umgebungsluft gehalten. Nach einer 10-minütigen Akklimatisationszeit wurden die Testsubstanzen kumulativ hinzugegeben (n ≥ 5) und für weitere jeweils 10 min inkubiert. Die Aufzeichnungsdauer betrug im Anschluss jeweils 1 min. Die Feldpotentialdauer (FPD) diente als Surrogat für die QT-Dauer; sie ist frequenzabhängig. Die Frequenzkorrektur erfolgte durch die Bazett-Formel (FPDc = FPD/√RR, RR = Intervall zwischen zwei Feldpotentialen) [7]. Arrhythmien und Unterbrechungen der elektrischen Erregung wurden ebenfalls aufgezeichnet.

Ergebnisse

Die untersuchten Herzglykoside vom Cadenolid-Typ wiesen eine dosisabhängige Verkürzung der frequenzkorrigierten Feldpotentiale (FPDc) auf. Thevetin A und Digoxin zeigten eine maximale FPDc-Verkürzung von -26,0 ± 1,6 %, bzw. -32,8 ± 1,4 % bei einer Konzentration von 1 000 nM. Beim Digoxin kam es zu einem Abbruch der elektrischen Erregung bei 3/6 Wells bei 1000 nM. Peruvosid und Digitoxigenin führten zu einer FPDc-Verkürzung von -18,4 ± 2,1 %, bzw. -36,9 ± 1,2 % bei 600 nM und zu einem Abbruch der elektrischen Erregung bei 1 000 nM. Oleandrin verursachte einen Abbruch der elektrischen Erregung in 6/6 Wells bei 600 nM und Neriifolin in 5/5 Wells bei 300 nM. Hierbei wurde eine FPDc-Verkürzung von -35,6 ± 0,9 % bei 300 nM, bzw. -28,1 ± 2,3 % bei 100 nM gemessen.

Weiterhin führten die untersuchten Herzglykoside dosisabhängig zu polymorphen tachykarden Arrhythmien (vgl. Abbildung 2).

Abb. 2: Polymorphe, tachykarde Rhythmusstörung im Microelectrode Array System. Diese könnte im Standard-EKG einer ventrikulären Tachykardie entsprechen (Quelle: N. Amend).

Eine Reihung der Herzglykoside nach dem Zeitpunkt des Abbruchs der elektrischen Erregung ergab folgende Reihung der Kardiotoxizität Neriifolin > Oleandrin > Digitoxigenin = Peruvoside > Digoxin > Thevetin A.

Diskussion und Fazit

Das Ziel der gegenwärtigen Studie war es, die Kardiotoxizität von N. oleander und T. peruviana in hiPSC-CM in einem Microelectrode Array Systemzu untersuchen. Eine mögliche wehrmedizinische Relevanz ergibt sich durch die einfache Verfügbarkeit der Pflanzen, die sehr hohe Toxizität einzelner Pflanzenteile in Fallberichten und durch den Umstand, dass Pflanzen bzw. deren toxische Inhaltsstoffe bereits für terroristische Zwecke missbraucht wurden [5][23].

Obwohl mehr als 30 verschiedene Herzglykoside in Oleanderarten beschrieben worden sind, war es notwendig, die relevantesten Vertreter zu identifizieren. Hierbei wurden Oleandrin und Digitoxigenin für N. oleander bzw. Thevetin A, Neriifolin und Peruvosid für T. peruviana ausgewählt [6][14][20][24]. Als Referenzsubstanz mit bekannter Kardiotoxizität diente Digoxin [20]. Diese Substanz zeigte in 50 % der Wells bei Konzentrationen von 1 000 nM Arrhythmien, die einem Kammerflimmern im Oberflächen-EKG ähnelten. Oleandrin verursachte einen Stillstand der Erregung in allen Wells bei einer Konzentration von 600 nM. Die toxischste Substanz, Neriifolin, zeigte bereits einen Stillstand der Erregung bei 300 nM in 100 % der Wells. Im Gegensatz dazu konnte bei Thevetin A im gegenwärtigen Modell keine Kardiotoxizität bis zu einer Konzentration von 1 000 nM nachgewiesen werden.

Die maximale Konzentration von 1 000 nM in der aktuellen Studie wurde aufgrund der klinischen Relevanz ausgewählt. So erreichen selbst schwere Vergiftungen kaum Plasmaspiegel, die im µ-molaren Bereich liegen [9]. Eine Reihung der untersuchten Herzglykoside nach deren Kardiotoxizität bzw. nach der Konzentration, die einen Stillstand der Erregung verursacht, ergibt, somit folgendes Bild: Neriifolin > Oleandrin > Digitoxigenin = Peruvosid > Digoxin > Thevetin A.

Ein weiteres elektrophysiologisches Phänomen, welches bei den untersuchten Herzglykosiden auftrat, waren Feldpotenzialverkürzungen von max. -36,9 ± 1,2 % (Digitoxigenin). Die Feldpotenziale korrelieren im klinischen Setting mit der QT-Zeit und geben einen Hinweis auf arrhythmogenes Potenzial. Sie lassen aber keinen direkten Rückschluss hinsichtlich schwerer Arrhythmien im Sinne einer Dosis-Wirkungs-Beziehung zu [17][18]. Dennoch kam es nur zu einem Erregungsstillstand, wenn signifikante Feldpotenzialveränderungen vorlagen.

Zur Einordnung der Toxizität von N. oleander und T. peruviana könnte die Zusammensetzung der einzelnen Pflanzenteile von Relevanz sein. So zeigte eine Studie von SARANAPAVANANTHAN et al., dass die Samen einen Massenanteil an Herzglykosiden von bis zu 4,8 % aufweisen können, die Blätter meist < 0,1 % [21]. Bei einem durchschnittlichen Gewicht von 3,3 mg pro Samen und berichteten tödlichen Dosen zwischen einem und zehn Samen könnte die tödliche Dosis für Menschen zwischen 160 µg und 1,6 mg liegen [9][12][20]. Therapeutisch ist weiterhin ungeklärt, ob die Anti-Digoxin Fab-Fragmente überhaupt das Neriifolin binden würden, also die Substanz mit der höchsten Toxizität im aktuellen Modell.

Die aktuelle Studie zeigt, dass die Herzglykoside aus N. Oleander und T. Peruviana eine sehr hohe Kardiotoxizität im Microelectrode Array System aufweisen. Eine wehrmedizinische Relevanz könnte sich aus der hohen Toxizität bei gleichzeitiger leichter Verfügbarkeit der Pflanzen ergeben. Somit könnten die Erforschung und Weiterentwicklung von Antidoten bei diesen in Mitteleuropa wenig beachteten Vergiftungen angezeigt sein.

Literatur

1. Amend N, Niessen KV, Seeger T et al.: Diagnostics and treatment of nerve agent poisoning-current status and future developments. Ann N Y Acad Sci 2020; 1479 (1): 13-28. mehr lesen
2. Amend N, Thiermann H, Worek F, Wille T: The arrhythmogenic potential of nerve agents and a cardiac safety profile of antidotes - a proof-of-concept study using human induced pluripotent stem cells derived cardiomyocytes (hiPSC-CM). Toxicol Lett 2019; 15 (308): 1-6. mehr lesen
3. Amend N, Worek F, Thiermann H, Wille T: Investigation of cardiac glycosides from oleander in a human induced pluripotent stem cells derived cardiomyocyte model. Toxicol. Lett. 2021; 350: 261-266. mehr lesen
4. Aslani MR, Movassaghi AR, Mohri M, Abbasian A, Zarehpour M: Clinical and pathological aspects of experimental oleander (Nerium oleander) toxicosis in sheep. Vet Res Commun 2004; 28 (7): 609-616. mehr lesen
5. Audi J, Belson M, Patel M, Schier J, Osterloh J: Ricin poisoning: A comprehensive review. JAMA 2005; 294 (18): 2342-2351. mehr lesen
6. Blum LM, Rieders F: Oleandrin distribution in a fatality from rectal and oral Nerium oleander extract administration. J Anal Toxicol 1987; 11 (5): 219-221. mehr lesen
7. Cavero I, Guillon J-M, Ballet V et al.: Comprehensive in vitro Proarrhythmia Assay (CiPA): Pending issues for successful validation and implementation. J Pharmacol Toxicol Methods 2016; 81: 21-36. mehr lesen
8. Chiarlo B, Cajelli E, Gastaldo P, Profumo P: Isolation of oleandrin by preparative layer chromatography. Relationship between oleandrin content and cambium rhythm. Chromatographia 1978; 11 (4): 229-232.
9. Eddleston M, Ariaratnam CA, Meyer WP et al.: Epidemic of self-poisoning with seeds of the yellow oleander tree (Thevetia peruviana) in northern Sri Lanka. Trop Med Int Health 1999; 4 (4): 266-273. mehr lesen
10. Eddleston M, Ariaratnam CA, Sjöström L et al.: Acute yellow oleander (Thevetia peruviana) poisoning: Cardiac arrhythmias, electrolyte disturbances, and serum cardiac glycoside concentrations on presentation to hospital. Heart 2000; 83 (3): 301-306. mehr lesen
11. Eddleston M, Senarathna L, Mohamed F et al.: Deaths due to absence of an affordable antitoxin for plant poisoning. The Lancet 2003; 362 (9389): 1041-1044. mehr lesen
12. Herrera J: The reproductive biology of a riparian Mediterranean shrub, Nerium oleander L. (Apocynaceae). Botanical Journal of the Linnean Society 1991; 106 (2): 147-172. mehr lesen
13. Kaplan JH: The sodium pump and hypertension: A physiological role for the cardiac glycoside binding site of the Na,K-ATPase. Proc Natl Acad Sci U S A 2005; 102 (44): 15723-15724. mehr lesen
14. Langford SD, Boor PJ: Oleander toxicity: An examination of human and animal toxic exposures. Toxicology 1996; 109 (1): 1-13. mehr lesen
15. Magdy T, Schuldt AJT, Wu JC, Bernstein D, Burridge PW: Human Induced Pluripotent Stem Cell (hiPSC)-Derived Cells to Assess Drug Cardiotoxicity: Opportunities and Problems. Annu Rev Pharmacol Toxicol 2018; 58: 83-103. mehr lesen
16. Montrucchio G, Bosso S, Scanu M et al.: Oleander poisoning: An old toxic in the modern era. Minerva Anestesiol 2020; 86 (3): 355-356. 
17. Nozaki Y, Honda Y, Watanabe H et al.: CSAHi study: Validation of multi-electrode array systems (MEA60/2100) for prediction of drug-induced proarrhythmia using human iPS cell-derived cardiomyocytes -assessment of inter-facility and cells lot-to-lot-variability. Regul Toxicol Pharmacol 2016; 77: 75-86. mehr lesen
18. Nozaki Y, Honda Y, Watanabe H et al.: CSAHi study-2: Validation of multi-electrode array systems (MEA60/2100) for prediction of drug-induced proarrhythmia using human iPS cell-derived cardiomyocytes: Assessment of reference compounds and comparison with non-clinical studies and clinical information. Regul Toxicol Pharmacol 2017; 88: 238-251. mehr lesen
19. Pietsch J, Oertel R, Trautmann S et al.: A non-fatal oleander poisoning. Int J Legal Med 2005; 119 (4): 236-240. mehr lesen
20. Roberts DM, Gallapatthy G, Dunuwille A, Chan BS: Pharmacological treatment of cardiac glycoside poisoning. Br J Clin Pharmacol 2016; 81 (3): 488-495. mehr lesen
21. Saravanapavananthan N, Ganeshamoorthy J: Yellow oleander poisoning — A study of 170 cases. Forensic Sci Int 1988; 36 (3-4): 247-250. mehr lesen
22. Taheri S, Solati A, Moradi P, Tavassoly A, Yadi J: Toxic effects of Nerium oleander aqueous leaf extract on haematological parameters and histopathological changes of the lungs and heart in rabbits. Comp Clin Pathol 2013; 22 (6): 1189-1193. mehr lesen
23. Tatsuo Yamauchi 1974: Process for isolating oleandrin from Nerium Odorum, US 3833472 A mehr lesen
24. Voigtländer HW, Balsam G, Herbst G: Uber Acetyl-Cardenolide aus Thevetia peruviana. Arch Pharm Ber Dtsch Pharm Ges 1969; 302 (7): 538-544. mehr lesen
25. Wasfi IA, Zorob O, Al katheeri NA, Al Awadhi AM: A fatal case of oleandrin poisoning. Forensic Sci Int 2008; 179 (2-3): e31-6. mehr lesen
26. Wong A, Greene SL: Successful treatment of Nerium oleander toxicity with titrated Digoxin Fab antibody dosing. Clin Toxicol (Phila) 2018; 56 (7): 678-680. mehr lesen

Manuskriptdaten

Zitierweise

Amend N, Worek F, Wille T: Die Kardiotoxizität von Oleander – eine unterschätzte Gefahr mit wehrmedizinischer Relevanz? WMM 2023; 67(3): 83-86.

DOI: https://doi.org/10.48701/opus4-100

Für die Verfasser

Oberfeldarzt Dr. Niko Amend

Institut für Pharmakologie und Toxikologie der Bundeswehr

Neuherbergstraße 11, 80937 München

E-Mail: nikoamend@bundeswehr.org

Manuscript Data

Citation

Amend N, Worek F, Wille T: Cardiotoxicity of Oleander – An Underestimated Hazard with Relevance in Military Medicine? WMM 2023; 67(3): 83-86.

DOI: https://doi.org/10.48701/opus4-100

For the authors

Lieutenant Colonel (MC) Dr. Niko Amend

Bundeswehr Institute of Pharmacology and Toxicology

Neuherbergstrasse 11, D-80937 München

E-Mail: nikoamend@bundeswehr.org