Intraoperativ-geformte (Palacos^®) versus CAD-CAM-PMMA-Kranioplastiken nach (dekompressiver) Kraniektomie: Eine retrospektive Single-Center-Analyse von 359 Fällen

Hädrich D^{a, b}, Lilla N^{b, c}, Ernestus R-I^b, Westermaier T^b

^a Bundeswehrzentralkrankenhaus Koblenz KlinikIV – Augenheilkunde

^b Universitätsklinik Würzburg, Neurochirurgische Klinik und Poliklinik

^c Universitätsklinik Magdeburg, Neurochirurgische Klinik

Hintergrund und Wehrmedizinische Relevanz

Im aktuellen russischen Angriffskrieg in der Ukraine wird über eine Rate von ca. 35 % Schädel- und Nackenverletzungen berichtet [18]. Nach ballistischer oder explosionsassoziierter Einwirkung am Schädel kann in der Folge eine dekompressive Kraniektomie erforderlich werden. In den US-amerikanischen Einsätzen im Irak und in Afghanistan war dies der führende neurochirurgische Eingriff im Bereich der Role 2 und Role 3 mit insgesamt 1 704 Kraniektomien [20].

Die Kranioplastik (auch Schädeldachplastik) ist ein neurochirurgisches Verfahren, welches die Funktionalität und Ästhetik des Patientenschädels nach der Kraniektomie wiederherstellt. Die Deckung des entstandenen Knochendefektes ist wichtig, weil dadurch der zerebrale Metabolismus verbessert, das „Syndrome of the trephined“ or „sinking skin flap syndrome“ verhindert und die soziale und neurologische Rehabilitation ermöglicht werden kann [9].

Wenn der autologe Knochendeckel nicht mehr verwendet (z. B. durch Zerstörung oder Verlust) oder nicht ausreichend konserviert werden kann (Kryokonservierung bei -80°C), können alloplastische Materialien zur Deckung genutzt werden. Hierbei werden insbesondere Polyetheretherketon (PEEK), Hydroxylapatit, Titan oder Polymethylmethacrylat (PMMA) im klinischen Alltag verwendet [22]. PMMA kommt bereits seit den 1950er-Jahren als alloplastisches Material bei Kranioplastiken zum Einsatz [1], jedoch zumeist als intraoperativ freihand-gefertigtes Implantat mittels Palacos^®-Knochenzement. Neben hohen Komplikationsraten bei Kranioplastiken allgemein [2], wird insbesondere bei den intraoperativ-gefertigten Palacos^®-PMMA-Implantaten von einem unbefriedigenden subjektiven ästhetischen Ergebnis berichtet [5]. Daher gibt es seit den 1990er-Jahren eine intensive Forschung an patientenspezifischen, 3D-konstruierten Implantaten. Diese Technik, auch als CAD-CAM (Computer-Aided Design, Computer-Aided Manufacturing) bezeichnet, kann die Wiedergabe der natürlichen Schädelkontur ermöglichen [16].

Im Vorfeld der Operation wird eine Dünnschicht-Computertomografie (CT) des Schädels inklusive des Schädeldefektes durchgeführt, dieses in eine Software ein­gepflegt und der Defekt mittels Implantats gedeckt (Abbildung 1). Mit verschiedenen präoperativen Optionen (z. B. Vorverplattung des Implantats, siehe Abbildung 2) kann eine Optimierung des Operationsergebnisses erreicht werden [17].

Abb. 1: Bild a und b: Rekonstruktion des Defektes und Erstellung des Implantats mittels Software [14]; rechtes Bild: Stereolithografiemodell (Bildquelle: Autor)

Die Fragestellung der Studie besteht darin, inwiefern die CAD-CAM-PMMA-Implantate den Palacos®-Implantaten hinsichtlich eingriffsbezogener, ökonomischer und ästhetischer Ergebnisse überlegen ist. Zur Beantwortung dieser Fragestellung wurden in der vorliegenden Studie beide Implantate im Hinblick auf perioperative Modalitäten, kurz- und langfristige Komplikationsraten und ästhetische Ergebnisse verglichen.

Methoden

Die Studie ist als retrospektive Single-Center-Analyse konzipiert und umfasst 350 Patienten mit insgesamt 359 Kranioplastiken zwischen 2005 und 2018, die in der Neurochirurgischen Klinik und Poliklinik der Universitätsklinik Würzburg operiert wurden. Palacos^®-Patienten (n = 133) erhielten zwischen 2005 und 2012 eine Kranioplastik. Den CAD-CAM-Patienten (n = 226) wurden zwischen 2010 und 2018 ein Implantat der Firma Zimmer Biomet GmbH (Freiburg i. B.) eingesetzt. Die Krankenakten wurden retrospektiv ausgewertet und umfassten demografische Daten, patientenspezifische Risikofaktoren und Vorerkrankungen, Daten zur Kranioplastik (Größe, Ort), chirurgische Daten sowie postoperative Komplikationen. Diese postoperativen Komplikationen wurden nach der Erforderlichkeit einer Revisions-Operation in kurzfristige (< 30 Tage) und langfristige (> 30 Tage) Komplikationen unterteilt. Die Größe des Defekts wurde bei fehlender Dokumentation anhand der Ellipsenformel Fläche A = π*(a/2)*(b/2) (a = Hälfte der maximalen kranio-kaudalen Ausbreitung, b = Hälfte der maximalen rostro-dorsalen Ausbreitung) berechnet.

Abb. 2: Intraoperativer Situs: rechts: Wiedereröffneter Kraniektomiedefekt, links: Deckung des Defekts mittels vorverplatteten CAD-CAM-Implantats (Bildquelle: Autor)

Grundsätzlich wurden alle Patienten, die im genannten Zeitraum eine Kranioplastik erhielten, und jedes Implantat in die Analyse einbezogen und als einzelner Fall gezählt. Eine Ausnahme bildete ein Revisionsimplantat. Es wurden keine Einschränkungen hinsichtlich des Patientenalters, der minimalen oder maximalen Größe des Schädeldefekts oder Vorerkrankungen festgelegt. Bei einem einzeitigen Vorgehen musste die Operationsdauer ausgeschlossen werden, da eine Differenzierung in Kraniektomie und Kranioplastik nicht möglich war.

Die ästhetischen Ergebnisse der Kranioplastiken wurden per Telefoninterview evaluiert. Hierfür wurde ein Fragebogen zur Erhebung der subjektiven Zufriedenheit mit dem ästhetischen Ergebnis erstellt. Die Patienten wurden über das Forschungsprojekt informiert und um eine schriftliche Einverständniserklärung ersucht. Anschließend wurden sie gebeten, das subjektive ästhetische Ergebnis auf einer 5-Punkte-Skala zu bewerten: „sehr unzufrieden“ (1 Punkt), „unzufrieden“ (2 Punkte), „teilweise zufrieden“ (3 Punkte), „zufrieden“ (4 Punkte) und zum Zeitpunkt der Befragung „sehr zufrieden“ (5 Punkte).

Die Auswertung aller beschriebenen Daten erfolgte nach Prüfung und Zustimmung durch die Ethikkommission der Universität Würzburg mit dem Aktenzeichen 20200205 03.

Ergebnisse

Das Studienkollektiv unterteilt sich in 63,1 % (n = 226) CAD-CAM-PMMA-Implantate und 36,9 % (n = 133) Palacos^®-Implantate. Palacos^®-Patienten (60,2 % Männer, 39,8 % Frauen) und CAD-CAM-Patienten (59,7 % Männer, 40,3 % Frauen) erhielten eine Kranioplastik mehrheitlich aufgrund eines vorangegangenen Schädel-Hirn-Traumas. Das mittlere Intervall zwischen Kraniektomie und Kranioplastik war bei beiden Implantatgruppen ähnlich (Palacos^®: 110 Tage, CAD-CAM: 105 Tage). In beiden Gruppen war die Kranioplastik am häufigsten rechtshemisphärisch und hatte eine durchschnittliche Größe von 75,46 ± 26,12 cm² (Palacos^®) und 90,87± 32,26 cm² (CAD-CAM).

Hinsichtlich der operativen Parameter zeigten sich für beide Implantate unterschiedliche Ergebnisse.
CAD-CAM-Patienten (145,10 ± 45,27min) hatten eine signifikant (p < 0.001) kürzere Operationszeit als Palacos^®-­Patienten (199,00 ± 80,23 min). Auch der intraoperative Blutverlust bei CAD-CAM-Implantaten (300,55 ± 220,67 ml) war signifikant (p < 0.001) geringer als in der Palacos^®-Gruppe. Zudem hatten CAD-CAM-Patienten (7,57 ± 4,26 Tage) im Vergleich zu Palacos^®-Patienten (8,70 ± 4,35 Tage) einen signifikant kürzeren (p < 0.001) postoperativen Krankenhausaufenthalt.

Operative Revisionen traten bei CAD-CAM-Implantaten weniger häufig auf (12,8 % vs. 15,8 %). Im Kurzzeitverlauf (< 30 Tage) war der Hauptgrund dafür in beiden Gruppen ein epidurales Hämatom mit gleichen Anteilen (5,8 %). Im Langzeitverlauf (>30 Tage) zeigten sich Unterschiede zwischen beiden Gruppen. Bei Palacos^®-Patienten ereigneten sich im Vergleich zu CAD-CAM signifikant häufiger Implantatdislokationen (p < 0.001).

Postoperative Infektionen traten in 3,8 % der Palacos^®-Fälle und nur in 1,8 % der CAD-CAM-Fälle auf. Allerdings zeigten sich bei CAD-CAM-Patienten signifikant (p < 0.001) mehr postoperative revisionsbedürftige Wundheilungsstörungen (WHS). Im Kontext dieser WHS waren insgesamt signifikant mehr kranielle Voroperationen bzw. Wiedereröffnungen des Hautschnittes bei CAD-CAM-Patienten zu sehen (p < 0.01). Im Vergleich zur Gruppe der Palacos^®-Patienten zeigte insbesondere das CAD-CAM-Kollektiv mit WHS nahezu doppelt so viele Wiedereröffnungen des kraniellen Hautschnittes (Abbildung 3).

Abb. 3: Boxplot zum Vergleich der Anzahl der Wiedereröffnungen des kraniellen Hautschnittes: Die Patienten mit WHS zeigten nahezu doppelt so viele Wiedereröffnungen als Palacos^®-Patienten.

Bei CAD-CAM-Patienten zeigten sich zudem signifikant (p < 0.05) weniger nicht-revisionspflichtige Komplikationen (z. B. Wundpolster, Liquorpolster).

Das ästhetische Ergebnis konnte bei 27,8 % (n = 37) der Palacos^®-Patienten und 25,2 % (n = 57) der CAD-CAM-Fälle beurteilt werden. Palacos^®-Patienten (M = 3,97, SD = 1,28) waren im Durchschnitt etwas weniger zufrieden als CAD-CAM-Patienten (M = 4,23, SD = 1,00), obwohl beide Gruppen das ästhetische Ergebnis als „zufrieden“ bewerteten. Es konnte kein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Implantatgruppen nachgewiesen werden (p > 0.05).

Diskussion

Die vorliegende Studie ist die derzeit weltweit größte Single-Center-Studie zum Vergleich von freihand-modellierten Palacos^®- und CAD-CAM-PMMA-Kranioplastiken. Wir konnten für CAD-CAM-Implantate im Vergleich zu Palacos^®-Implantaten überlegene Ergebnisse im Bereich der intra- und postoperativen Parameter zeigen, die zum Teil hochsignifikant waren.

Operationszeit/Blutverlust/stationäre Behandlungsdauer

Die signifikant kürzere Operationszeit und der signifikant geringere intraoperative Blutverlust bei CAD-CAM-Patienten konnten in einigen Studien bereits gezeigt werden, jedoch anhand deutlich geringerer Fallzahlen [16].

Generell können die präoperative Anfertigung, die Möglichkeit der Vorverplattung der Implantate und ein vereinfachter Insertionsprozess als mögliche Gründe für die kürzere Operationszeit angesehen werden [17].

Ein weiteres wichtiges Ergebnis unserer Arbeit war die signifikant kürzere postoperative Hospitalisierung von CAD-CAM-Patienten im Vergleich zu Palacos®-Patienten. Eine Erklärung könnte die schnellere allgemeine und neurologische Rehabilitation der Patienten mit vorgefertigten Implantaten sein [4].

Komplikationsraten

Ein Schwerpunkt unserer Studie war der Vergleich hinsichtlich Kurz- und Langzeitkomplikationen. Allgemeine Komplikationsraten für Kranioplastiken liegen im Bereich zwischen 12 % und 50 % [3][8]. Wir zeigten bei beiden Implantaten eine Komplikationsrate im unteren Bereich, wenngleich CAD-CAM-Implantate weniger revisionspflichtige Komplikationen aufwiesen (12,8 %). In den meisten Studien wird nicht zwischen intraoperativ-geformten und präoperativ-hergestellten PMMA-Kunststoffen unterschieden [6], was die Vergleichbarkeit der Ergebnisse erschwert. Mögliche Faktoren, die die postoperativen Komplikationen beeinflussen, wie z. B. die Grunderkrankung des Patienten, das Alter des Patienten, das Operationsverfahren, die Erfahrung des Chirurgen oder bestimmte Indikationen für eine Kranioplastik, konnten in unserer Studie nicht nachgewiesen werden.

CAD-CAM-Patienten waren mit 1,8 % weniger anfällig für postoperative Infektionen als Palacos^®-Patienten mit 3,8 %. In der Literatur werden zwischen 6 % und 11 % Infektionen für intraoperativ-geformte PMMA-Implantate und 7 % für CAD-CAM-PMMA-Implantate angegeben [15][21]. Im Vergleich zu diesen Studien sind die Infektionsraten für beide Implantate in unserer Studie sehr niedrig.

Eine Erklärung für die geringere Infektionstendenz bei CAD-CAM-Implantaten könnte ihre poröse Struktur sein, die das Einwachsen in das umliegende Gewebe und die Penetration von Gefäßen ermöglicht und unterstützt. Darüber hinaus hat das CAD-CAM-Implantat eine negative Oberflächenspannung, die eine Anhaftung von Bakterien verhindert. In der Literatur werden auch patientenspezifische Merkmale als Einflussfaktoren für Infektionen diskutiert. Insgesamt konnten wir keine patientenspezifischen Faktoren identifizieren, die die Infektionsrate beeinflussen.

Im Langzeitverlauf fanden sich signifikant (p < 0.001) mehr WHS bei CAD-CAM-Kranioplastiken. Die Studienlage hierzu ist nicht eindeutig [7][12]. In unserer Studie lässt sich die erhöhte Anzahl von WHS bei CAD-CAM-Implantaten durch die stark erhöhte Anzahl von kraniellen Voroperationen bzw. Wiedereröffnungen des kraniellen Hautschnittes in dieser Gruppe erklären. Die mehrfachen Wiedereröffnungen des vorangegangenen Hautschnittes könnten zu WHS prädisponiert haben. Eine weitere Ursache könnte sein, dass die CAD-CAM-Implantate aufgrund der besseren Nachbildung der natürlichen Schädelkontur mehr Spannung auf der Haut erzeugten als Palacos®- Implantate. Ebenso könnte die deutlich größere Implantatgröße bei CAD-CAM im Vergleich zu Palacos® zu einer größeren Wundfläche oder Naht und einem entsprechend erhöhten Risiko für WHS geführt haben.

In der vorliegenden Studie zeigten die Palacos^®-Implantate signifikant (p < 0.001) mehr postoperative Dislokationen im Langzeitverlauf als CAD-CAM-Implantate. Dies entspricht den Ergebnissen weiterer Studien [21]. Ein Grund für die Dislokationstendenz bei Palacos^® könnte die verstärkte Freisetzung von Sauerstoffradikalen im Rahmen des Polymerisationsprozesses sein, welches zu Mikrobewegungen zwischen Material und Knochen führt [19]. Weiterhin kann das Material während des Aushärtungsprozesses schrumpfen [13].

Postoperative Ästhetik

Hinsichtlich der postoperativen Ästhetik zeigten sich bei den CAD-CAM-Implantaten bessere Ergebnisse als bei Palacos^®-Implantaten. Die Literaturrecherche ließ ein signifikant besseres Ergebnis zugunsten der CAD-CAM-Implantate erwarten, da vor allem die Freihand-Modellierung mit schlechteren ästhetischen Ergebnissen einherzugehen scheint [10]. Dies konnte in unserer Studie nicht bestätigt werden. Ein Grund dafür könnte die niedrige Anzahl an befragten Patienten sein. Zudem gibt es bis jetzt kein wissenschaftlich anerkanntes und geeignetes Messinstrument zur Bestimmung des ästhetischen und funktionellen Ergebnisses, das validiert ist und standardisiert angewendet werden kann [11]. Die Implementierung eines solchen Messinstruments ist neben der Erhöhung der Anzahl der befragten Patienten das Ziel weiterer Forschung, um aussagekräftige Ergebnisse und eine Vergleichbarkeit der Studien zu erreichen.

Fazit

Diese Studie zeigt eine Überlegenheit der CAD-CAM-Implantate gegenüber Palacos^®-Implantaten hinsichtlich peri- und postoperativen sowie ästhetischen Ergebnissen. Insbesondere die kürzere Operationszeit, die kürzere Hospitalisierung, der geringere intraoperative Blutverlust und der klare Trend für eine höhere Zufriedenheit mit dem ästhetischen Ergebnis spricht für die Verwendung der CAD-CAM-PMMA-Implantate. Zudem haben CAD-CAM-Implantate eine geringere Infektionsrate als Palacos^®-Implantate und zeigten positive Effekte, wenn sie in vorinfiziertes Gewebe implantiert wurden. Somit könnte die Nutzung von CAD-CAM-PMMA-Implantaten im klinischen Alltag bei Patienten nach Kraniektomie zu einer optimalen und langfristigen Versorgung beitragen. Weitere Studien sind jedoch erforderlich, um die langfristigen Komplikationsraten, insbesondere bei CAD-CAM-Implantaten, zu bewerten und die Stichprobengröße der Befragung zu erhöhen, um die Resultate im ästhetischen Ergebnis zu bestätigen.

Literatur

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Verfasser

Stabsarzt Dr. Dustin Hädrich

Bundeswehrzentalkrankenhaus Koblenz

Klinik IV – Augenheilkunde

Rübenacher Str. 170, 56072 Koblenz

E-Mail: dustinhaedrich@bundeswehr.org

Der Vortrag belegte den 2. Platz beim Wettbewerb um den Heinz-Gerngroß-Förderpreis 2023 der Deutschen Gesellschaft für Wehrmedizin und Wehrpharmazie e. V.

Validierung eines 4-Gensets zur Vorhersage der lebensgefährlichen akuten Strahlenkrankheit in einem Primatenmodell

Daniel Schwanke^a

^a Institut für Radiobiologie der Bundeswehr, München, in Verbindung mit der Universität Ulm

Einleitung

Radionukleare Ereignisse sind Großschadensereignisse, im Rahmen derer innerhalb kurzer Zeit mit tausenden strahlenexponierten zivilen und militärischen Verletzten gerechnet werden muss. Für eine gute Prognose sind eine frühe Triage und das rechtzeitige Einsetzen therapeutischer Maßnahmen essenziell [5]. Grund hierfür ist die zeitverzögerte Manifestation der akuten Strahlenkrankheit (ASK). Um baldigst mit der Behandlung der ASK zu beginnen, sind diagnostische Marker erforderlich, die bereits zum frühestmöglichen Zeitpunkt erhoben werden können. Klinische Symptome (Prodromalsymptome) sind aufgrund der Unsicherheit des Auftretens und ihrer geringen Spezifität nur bedingt für die Abschätzung des weiteren Verlaufs der ASK geeignet. Zudem muss der Marker aus zuvor genannten Gründen hochdurchsatzfähig sein, also eine große Zahl von Untersuchungen in kurzer Zeit ermöglichen.

In Kooperation mit dem französischen militärischen Schwesterinstitut (Institut de Recherche Biomédicale des Armées, IRBA) des Instituts für Radiobiologie der Bundeswehr (InstRadBioBw) konnte in Genexpressionsanalysen an bestrahlten Pavianen ein vielversprechendes Genset bestehend aus DDB2, FDXR, POU2AF1 und WNT3 identifiziert werden [7–9]. Weitere Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe an ganzkörperbestrahlten Leukämiepatienten in Zusammenarbeit mit unseren tschechischen militärischen Kooperationspartnern erlaubten eine Validierung. Dies war jedoch zum einen nur an einer kleinen Anzahl an Patienten möglich, zum anderen führte die Grunderkrankung zu einer supprimierten Reaktion des Transkriptoms [12][14]. Zur Validierung sind im Besonderen gesunde, ganzkörperbestrahlte Kohorten erforderlich, wie dies beim Einsatz einer nuklearen Bombe (Hiroshima und Nagasaki) bzw. des Kernkraftwerkunfalls von Tschernobyl erlebt wurde. In Zusammenarbeit mit unserem amerikanischen militärischen Kooperationspartner vom Armed Forces Radiobiology Research Institute (AFRRI) ergab sich die Möglichkeit, Blutproben von Rhesusaffen aus einer bereits laufenden tierexperimentellen Studie zu erhalten. Im Rahmen dieser Studie wurde die Wirksamkeit eines Medikaments zur Behandlung der akuten Strahlenkrankheit (γ-Tocotrienol-(GT3)) zu verschiedenen Zeitpunkten vor und nach Bestrahlung untersucht. So war es möglich, eine entscheidende Validierung des o.g. Gensets an gesunden, ganzkörperbestrahlten Individuen durchzuführen.

Material und Methoden

Am AFRRI wurden 41 (27 männliche, 14 weibliche, Tabelle 1) Rhesusaffen der Spezies Macaca mulatta entweder mit 5,8 Gy; 6,5 Gy oder 7,2 Gy (Ganzkörperbestrahlung, Einzeldosis) bestrahlt. Dabei wurde den Tieren vor Bestrahlung und an den Tagen 1, 2, 3, 35 und 60 nach Bestrahlung 1 ml peripheres Blut in PAXgene^® Blood RNA Tubes (PreAnalytiX^®; Quiagen^®; Becton, ­Dickinson, and Company; Franklin Lakes, NJ) abgenommen. Zudem wurde einem Teil der non-human primates (NHP) γ-Tocotrienol (GT3) s.c. (37,5 und 75 mg/kg) vor der Bestrahlung verabreicht. Der nicht behandelte Teil der Kohorte erhielt eine Placebolösung s.c. injiziert.

Tab. 1: Verteilung der Tiere über die untersuchten Untergruppen sortiert nach Strahlendosis, Geschlecht, Behandlungsgruppe und Überlebensstatus

Bei den applizierten hohen Dosen ionisierender Strahlung war ein schwerer Verlauf der akuten Strahlenkrankheit in diesem Tiermodell zu erwarten. Erreichten die Tiere ein vordefiniertes moribundes Stadium, wurden sie unter Beachtung des örtlich geltenden Tierschutzes eingeschläfert und als „letal erkrankt“ eingestuft. Tiere, die 60 Tage ohne Erreichen dieses Stadiums überlebten, wurden als „überlebend“ eingestuft und abschließend ebenfalls eingeschläfert.

Die gewonnenen Blutprobenröhrchen wurden über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert, am nächsten Tag bei -80 °C tiefgefroren, gesammelt und nach Beendigung des Experimentes an das InstRadBioBw versandt. Hier erfolgte die semi-automatische RNA-Isolation der Blutproben von 41 zufällig ausgewählten NHP. Die extrahierten RNA-Proben wurden bezüglich ihrer Qualität und Quantität untersucht. Es wurden 500 ng Gesamt-RNA mittels High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems™, Life Technologies, Darmstadt, Germany) in cDNA konvertiert. Zur Quantifizierung der RNA ­Kopienanzahl von FDXR (Hs01031617_m1), DDB2 (Hs00172068_m1), POU2AF1 (Hs01573371_m1) und WNT3 (Hs00902257_m1) wurden pro Reaktion 10 ng cDNA, PCR-Master-Mix und genspezifische TaqMan-Assays verwendet. Die quantitative Echtzeitpolymerasekettenreaktion (qRT-PCR) in Duplikat-Messung erfolgte im 96-Wellformat mittels QuantStudio™ 12K OA Real-Time PCR System (Thermo Fisher SCINTIFIC Inc., Waltham, Massachusetts, USA). Im Rahmen der qRT-PCR korreliert die RNA-Kopienanzahl eines Gens mit dem sogenannten Ct-Wert (Cycle threshold). Die Raw-Ct-Werte der Gene wurden gegen den 18S rRNA Ct-Wert normalisiert. Unterschiede in der Genexpression wurden mittels des -ΔΔCt-Verfahrens () quantifiziert (Fold-Change = FC). Dabei wurde der normalisierte Ct-Wert jedes Gens vor Bestrahlung als Referenz verwendet. Unter Berücksichtigung der methodischen Varianz des Verfahrens wurden um den Faktor 2 veränderte Genexpressionsmessungen als unterschiedlich zu Kontrollwerten betrachtet (unbestrahlte Genexpressionsmessungen wurden auf eins gesetzt). Die statistische Analyse erfolgte mittels Varianzanalyse (Analysis of variance, ANOVA) und Zwei-­Wege ANOVAs, sowie Analysen zur „Receiver-Operator-Characteristics“.

Ergebnisse

Änderungen der Genexpression

Die Expression von FDXR und DDB2 nach Bestrahlung war bereits am zweiten (FDXR) bzw. am ersten Tag nach Bestrahlung (DDB2) im Median signifikant erhöht (2,3-fach bzw. 3,4-fach; p < 0.,001, Abbildung 1). Die Expression stieg kontinuierlich bis zum dritten Tag nach Bestrahlung (3,5-fach bzw. 13,5-fach), um dann am 35. Tag nach Bestrahlung herunterreguliert zu sein. Am Tag 60 nach Bestrahlung wurden differenzielle Genexpressionsänderungen wie in unbestrahlten NHP gemessen.

Für POU2AF1 konnte bereits am ersten Tag nach Bestrahlung eine etwa 8-fach erniedrigte Expression relativ zur unbestrahlten Referenz gezeigt werden, die auch am 35. Tag nach Bestrahlung gemessen wurde (Abbildung 1). Am Tag 60 nach Bestrahlung wurden differenzielle Genexpressionsänderungen wie in unbestrahlten NHP festgestellt.

Abb. 1: Graphen der differenziellen Expression der 4 Gene vor und an den Tagen nach Bestrahlung (oberer Teil FDXR und DDB2, unterer Teil WNT3 und POU2AF1). Die Symbole zeigen den Median aller Tiere zum jeweiligen Tag an. Signifikante Unterschiede in der Genexpression zur unbestrahlten Referenz vor Bestrahlung sind mit Sternchen gekennzeichnet (*p-value < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001). Die graue Fläche im Hintergrund stellt einen angenommenen Sicherheitsbereich dar. Werte in diesem Bereich (FC zwischen 0,5 und 2,0) lassen keine sichere Unterscheidung zwischen methodischer Varianz und tatsächlicher Änderung der Genexpression zu. Die unterbrochene horizontale weiße Linie bezieht sich auf einen FC von 1, als Referenz für die Genexpression vor Bestrahlung.

WNT3 zeigte in dieser Studie eine hohe Varianz; es konnte lediglich am Tag 35 nach Bestrahlung eine supprimierte Expression gezeigt werden, während an den anderen Tagen keine eindeutigen Unterschiede zur unbestrahlten Referenz nachweisbar waren (Abbildung 1).

Kombination der Genexpressionsmessungen

Die Kombination der Genexpressionsmessungen von DDB2 und POU2AF1 an jedem der ersten 3 Tage nach Bestrahlung erlaubten eine vollständige Diskriminierung der unbestrahlten von den bestrahlten Tieren (AUC = 1). AUCs ≥ 0,88 wurden für die einzelnen Gene ermittelt (Abbildung 2). Analysen zu Unterschieden in Geschlechtern und Behandlungsgruppen (GT3 versus Placebo) hatten keinen Einfluss auf die hier gezeigten Ergebnisse.

Abb. 2:Sensitivität gegenüber der 1-Spezifität in einer Receiver-Operator-Characteristics (ROC)-Kurve für die Tage 1–3 nach Bestrahlung für DDB2 und POU2AF1, sowie in einem bivariaten Modell dieser beiden Gene: Die AUC gibt die Fläche unter der Kurve für jedes der beiden Gene einzeln und kombiniert wieder (bivariates Modell).

Diskussion

Die gestiegene Wahrscheinlichkeit eines radionuklearen Ereignisses durch die sich weltweit verschärfende Sicherheitslage erfordert Maßnahmen im Sinne einer „preparedness“. Eine hochdurchsatzfähige Frühdiagnostik ermöglicht eine frühe und suffiziente Triage, die wiederum für eine effektive Zuteilung der begrenzten medizinischen Ressourcen, wie z. B. Intensivbetten, relevant ist [3]. Besonders für die akute Strahlenkrankheit gilt, dass eine möglichst frühe Therapie, noch vor Auftreten erster Symptome, die Prognose des Patienten und somit seine Überlebenswahrscheinlichkeit entscheidend verbessert [4][5].

Hohe diagnostische Sicherheit

Diese Studie hatte zum Ziel, ein bereits in Pavianen und humanen in vivo- bzw. ex vivo-Proben identifiziertes molekularbiologisches Diagnosewerkzeug entscheidend zu validieren [1][2][6][7][9–12]. Für 3 der 4 Gene konnte diese Validierung mit einer gezeigten hohen diagnostischen Sicherheit erfolgreich geführt werden. Dabei war die Expression dieser Gene und insbesondere ihre diagnostische Aussage zum Verlauf der akuten Strahlenkrankheit nahezu unabhängig von der hier verabreichten Bestrahlungsdosis, dem Geschlecht, dem Überlebensstatus und der Behandlung mit GT3. Im Unterschied zu Pavianen war FDXR, wie auch im humanen Modell, im Rhesus-Modell nach Bestrahlung hochreguliert [1][7][8]. Jedoch im Unterschied zum humanen Modell war hier DDB2 im Vergleich zu FDXR stärker hochreguliert.

Vorhersage des Verlaufs einer ASK

Weiterhin konnte durch die im Unterschied zu vielen anderen Studien prolongierte Beobachtungsphase nach Bestrahlung das vorgestellte Modell zur Vorhersage des Verlaufs der ASK weiter studiert werden. So zeigte sich am Tag 35 eine generelle Supprimierung aller 4 Gene und am Tag 60 nach Bestrahlung ein Trend hin zu Kontrollwerten der unbestrahlten Referenz. Weitere Studien, die eine feinere Auflösung des Zeitraums zwischen 4 und 60 Tagen nach Bestrahlung erlaubten, würden dazu beitragen, die Verwendung des Verfahrens auf spätere Zeitpunkte nach Bestrahlung auszuweiten. Bezüglich des Einflusses der Behandlungs- und Placebogruppe sowie des Geschlechts sei auf die Originalpublikation verwiesen [13].

Macaca mulatta ist ungeeignet für die Validierung von WNT3

Das Gen WNT3 zeigte in diesem Tiermodell keine eindeutigen strahleninduzierten Genexpressionsänderungen. Somit ist dieses Tiermodell (Macaca mulatta) als nicht geeignet für die Validierung bereits gezeigter strahleninduzierter WNT3-Genexpressionsänderungen in bestrahlten humanen Blutproben einzustufen.

Fazit und Ausblick

Insgesamt konnte für 3 der 4 Gene (FDXR, DDB2 und POU2AF1) die hohe diagnostische Signifikanz der Prädiktion des Schweregrades der ASK gezeigt und erfolgreich validiert werden. Dies gibt Ausblick darauf, für ein künftiges radionukleares Ereignis den hier beschriebenen Arbeitsablauf durch z. B. das Multiplexen und die Verwendung einer One-Step-qRT-PCR zu beschleunigen. Auch die Entwicklung einer Point of Care-Diagnostik in Form einer Microfluidik-Karte als sogenanntes „Lab on a Chip“ könnte die frühe Differenzierung klinisch relevanter Gruppen wie unbestrahlte und tödlich exponierte Menschen weiter vereinfachen. Auch eine Point of Care-Sequenzierung mittels Nanopore-Sequencing kann hier weitere Vorteile bringen.

Zusammengefasst konnte an dieser Kohorte gesunder letal bestrahlter NHP das bereits identifizierte molekularbiologische Genset zur Früh- und Hochdurchsatzdiagnostik der ASK erfolgreich validiert werden. Mit diesem entscheidenden Experiment kann das Verfahren nunmehr zur Triage bei zukünftigen radionuklearen Ereignissen eingesetzt werden.

Literatur

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Verfasser

Oberstabsarzt Daniel Schwanke

Institut für Radiobiologie der Bundeswehr

Neuherbergstraße 11, 80937 München

E-Mail: danielschwanke@bundeswehr.org