Automatisierte Aufreinigungsmethoden und Screening-Assays für Interaktionen an der orthosterischen Bindungsstelle des nikotinischen Acetylcholinrezeptors

Fabian Springer^a,b, Marian Freisleben^a,c, Antonia Brüser^a, Thomas Seeger^a, Franz Worek^a, Lorenz Meinel^b, Karin Veronika Niessen^a

^a Institut für Pharmakologie und Toxikologie der Bundeswehr, München

^b Lehrstuhl für Pharmazeutische Technologie und Biopharmazie an der Julius-Maximilians-Universität Würzburg

^c Institut für Präzisionsmedizin an der Hochschule Furtwangen, Villingen-Schwenningen

Einleitung

Nervenkampfstoffe sind trotz internationaler Ächtung weiterhin eine potenzielle Bedrohung. Nach der präsynaptischen Ankunft eines Nervensignals wird der Neurotransmitter Acetylcholin (ACh) in den synaptischen Spalt freigesetzt. Dieser bindet an postsynaptische nikotinische Acetylcholinrezeptoren (nAChR), die damit eine Schlüsselrolle in der Signaltransduktion, insbesondere in der neuromuskulären Endplatte, besitzen. Die nAChR öffnen sich durch Bindung des Neurotransmitters ACh, was zum Einstrom von Natrium- bzw. Calciumionen entlang des elektrochemischen Gradienten in die Zelle führt. Dieser Ionenfluss verursacht eine Depolarisation der Zielzelle und führt letztendlich über mehrere Signalkaskaden zur Muskelkontraktion. Durch Abdiffusion und sofortigen Abbau durch das Enzym Acetylcholinesterase (AChE, 3.1.1.7) sinkt die Konzentration von ACh im synaptischen Spalt wieder. Die nAChR schließen sich [6].

Phosphororganische Verbindungen (organic phosphorous compounds, OPC) wie Nervenkampfstoffe hemmen die AChE. In Folge einer OPC-Intoxikation akkumuliert ACh im synaptischen Spalt. Ist der Rezeptor über eine längere Zeit erhöhten Konzentrationen an ACh ausgesetzt, wird der sogenannte desensitisierte Zustand, ein dysfunktionaler Rezeptorzustand stabilisiert. Charakteristisch für diesen Zustand ist, dass der Rezeptor geschlossen vorliegt und nicht mehr durch Agonisten aktivierbar ist [1]. Die derzeit etablierte Therapie adressiert die AChE in Form von Reaktivatoren (Obidoxim, Pralidoxim), unterstützt durch Benzodiazepine zur Behandlung der zentralnervösen Symptome. Antagonisten wie Atropin dämpfen die Wirkung des Ligandenüberschusses an den muskarinischen AChR (mAChR). Die Reaktivierung der durch Nervenkampfstoff gehemmten AChE ist nicht immer erfolgreich; insbesondere bei Soman-, Tabun- oder Novichok-Vergiftungen wird die Enzymfunktion nicht oder nur unzureichend wiederhergestellt [8]. Klinische Wirkstoffe, welche direkt mit dem nAChR interagieren und diesen wieder in einen funktionalen Zustand überführen, existieren derzeit nicht [2].

Computer Aided Drug Design (CADD) ist ein hocheffizientes Werkzeug zur Entwicklung von neuartigen pharmakologisch aktiven Verbindungen. In silico-Modellierung ermöglicht anhand von Structure-Activity-Rela­tionship (SAR)-Daten Vorhersagen zur biologischen Aktivität ausgehend von Leitsubstanzen. Die hierbei generierten Strukturvorschläge werden dann synthetisiert (sofern sie der Synthese zugänglich sind) und danach molekularpharmakologisch getestet. Es handelt sich also um einen iterativen Prozess: Molecular Modelling → Synthese → biologische bzw. pharmakologische Prüfung (Abbildung 1) [7].

Abb. 1: Iterativer Prozess zur Entwicklung neuer Wirkstoffe aus In silico-Modelling, Synthese und SAR-Datenbank.

Anhand der Structure-Activity-Relationship (SAR)-Daten kann die biologische und pharmakologische Aktivität von Substanzen vorhergesagt werden. Diese Daten können in der In silico-Modellierung zur Weiterentwicklung der Testsubstanzen genutzt werden. Entwickelte Substanzen werden anschließend synthetisiert und erneut getestet. Dieser iterative Prozess ermöglicht die zielgerichtete Verbesserung und Weiterentwicklung von pharmakologisch aktiven Substanzen. (Eigene Abbildung; Grafik erstellt mit BioRender; Orbit TC Nanion GmbH, München)

Zur Generierung von validen SAR-Daten für eine zielgerichtete Synthese ist die ständige Entwicklung geeigneter In-vitro-Testsysteme unabdingbar. Hierbei sind Daten zur Affinität an der orthosterischen Bindungsstelle sowie der Rezeptorfunktionalität von entscheidender Bedeutung.

Methodik

Die für Affinitäts- und Funktionalitätsassays benötigten Muskelsubtyp-nAChR wurden aus nativem Gewebe des Pazifischen Zitterrochens (Tetronarce californica, früher Torpedo californica) gewonnen. Aufgrund der phylogenetischen Entwicklung weist der nAChR einen hohen Grad an Homologie zwischen den Spezies und somit auch mit dem humanen Subtyp auf. Im Folgenden wird die Entwicklung von In-vitro-Modellsystemen zur Generierung von SAR-Daten vorgestellt.

1. Gewinnung von mikrosomalen Zellmembranfragmenten

Es wurde ein teilautomatisiertes skalierbares Hochdruck-Homogenisationsverfahren entwickelt. Hierbei erfolgte die Lysierung des tiefgefrorenen Gewebes mittels hyperosmolarer Pufferlösung und Scherkrafteinwirkung und die anschließende Reinigung der Zellmembranfragmente mittels Differenzialzentrifugation. Die Hochdruck-Homogenisation diente zum Aufschluss und zur homogenen Dispergierung des Materials. Die anschließende Charakterisierung erfolgte mittels Dynamic Light Scattering, Zeta-Potential-Messung, Bicinchoninsäure-Assay und Lichtmikroskopie [5].

2. Entwicklung eines Radioliganden-Bindungs­assays in einem neuen Format (Sättigungs- und Kompetitionsassay)

Nach dem Prinzip eines klassischen Radioliganden-Bindungsassays wurde ein spezieller Affinitätsassay entwickelt, der neben radioaktiven Substanzen auch den Einsatz hochtoxischer Verbindungen erlaubt. Dieser folgt dem Prinzip eines Scintillation Proximity Assays (SPA). Hierbei wurden die zuvor erzeugten rezeptorhaltigen Membranfragmente auf Beads, die in ihrem Inneren einen Szintillator enthielten, inkubiert. Der mit Tritium markierte nAChR-Agonist [³H]Epibatidin diente als Marker für die Affinität an der orthosterischen Bindungsstelle. Abhängig von der Affinität einer Testsubstanz wurde [³H]Epibatidin aus seiner Bindungsstelle verdrängt. Mit Hilfe des Szintillators konnte diese Verdrängung nachgewiesen werden. Der Wendepunkt der ermittelten Verdrängungskurve wird als mittlere inhibitorische Konstante (K_i) bezeichnet. Diese ist ein Maß für die Bindungsstärke der Testsubstanz. Anhand der berechneten Sättigungsisotherme können die Affinitätskonstante K_D und die maximale Anzahl an Bindungsstellen B_max ermittelt werden. Darauf aufbauend wurden Kompetitionsassays zur Ermittlung von Affinitätskennzahlen pK_i durchgeführt.

3. Weiterentwicklung der Rezeptoraufreinigung mittels Affinitätschromatografie

nAChR-haltige mikrosomale Membranfragmente wurden durch Zusatz eines Detergenz solubilisiert. Die aus der nativen Lipidumgebung herausgelösten Transmembranproteine wurden durch den Zusatz weiterer Lipide in der wässrigen Phase stabilisiert. Die Aufreinigung erfolgte mittels Affinitätschromatografie. Hierbei wurden die solubilisierten nAChR an den nAChR-Antagonist α-Bungarotoxin, der an die stationäre Phase gekoppelt wurde, gebunden. Weitere solubilisierte Proteine gingen keine Ligand-­Rezeptor-Interaktion ein und wurden von der Säule gewaschen. Um die an der stationären Phase gebundenen nAChR-haltigen Membranfragmente zu gewinnen, wurden mittels eines hochmolaren Zusatzes des nAChR-Agonisten Carbamoylcholin die nAChR vom α-Bungarotoxin abgelöst und als nAChR-Carbamoylcholin-Komplex eluiert. Die erhaltenen Fraktionen wurden im Anschluss mittels Gelelektro­phorese und Immunoblotting gegen ein nAChR-haltiges Referenzmaterial charakterisiert [4].

Ergebnisse

Die neu entwickelte Hochdruck-Homogenisationsmethode ermöglichte die Herstellung hoch standardisierter Zellmembranfragmente. Zur Ermittlung des optimalen Drucks wurden im Vorfeld verschiedenen Drücke (200–1 200 bar) getestet. Der Polydispersitätsindex (P_i, ein Maß der Partikelgrößenverteilung) sowie der hydrodynamische Durchmesser (Z_avg) wurden in Korrelation mit dem angewandten Druck minimiert, wobei initial die stärkste Abnahme der Startwerte zu beobachten war. Interessanterweise war die Laufzeit der Homogenisierungsläufe bei höheren Drücken nicht länger als bei niedrigeren Drücken. Allerdings stieg gerade bei höheren Drücken die Temperatur mit jeder Passage an (Abbildung 2).

Abb. 2: Temperaturentwicklung nach Homogenisationszyklus und angewendetem Druck.

Die Temperaturentwicklung zeigt eine deutliche Zunahme der Temperatur in Abhängigkeit von der Anzahl der Homogenisationszyklen (Anzahl der Passagen). Diese Temperaturzunahme trägt zu einer Destabilisierung der Rezeptorintegrität sowie einer Erhöhung der Membranfluidität bei. (Eigene Abbildung; AVP-2000 SPXflow-Technology, Moers)

Bereits nach fünf Homogenisationszyklen waren P_i und Z_avg stabil. Mehr Passagen brachten keinen Benefit, sondern waren eher kontraproduktiv, weil sie zu einer starken Degradation der nAChR führten (Abbildung 3). Die Proteinkonzentration, die photometrisch mittels Bicinchoninsäure-Assay als zusätzliches Qualitätskriterium bestimmt wurde, blieb durchgehend stabil. Zudem konnte das teilautomatisierte Verfahren die Chargenvarianz gegenüber der manuellen Aufarbeitung deutlich minimieren [5].

Abb. 3:Lichtmikroskopische Abbildungen (20-fache Vergrößerung, Hellfeld) der nAChR enthaltenden Zellmembranfragmente. Die Abbildungen zeigen den Zustand nach manueller Aufarbeitung mittels Dounce-Homogenisation sowie teilautomatisierter Hochdruckhomogenisation bei 400 bar und 1 000 bar. Die zugehörigen Sättigungsisotherme mit [³H]Epibatidin zeigen die Korrelation zwischen Druck und Rezeptorbeschaffenheit. So kann an der Abnahme von B_Max bei höherem Druck eine deutliche Degradation der nAChR festgemacht werden. (Eigene Abbildung; Grafik erstellt mit BioRender)

Der neuentwickelte SPA wurde auf einer temperaturkontrollierten automatisierten, modularen Pipettier- und Inkubierplattform etabliert. Dies reduzierte die Kontamination mit radioaktivem und toxischem Material auf ein Minimum. Im Sättigungsassay konnte eine Absättigung nahezu aller Bindungsstellen gezeigt werden, wenn 50 nM [³H]Epibatidin bei 2,5 µg rezeptorhaltigen Membranfragementen eingesetzt werden.

Zusätzlich wurde der SPA gemäß den Kriterien der European Medical Agency (EMA) sowie der Food and Drug Administration (FDA) in den Bereichen Präzision und Lösemittelbeständigkeit teilvalidiert. Zur Methodenverifikation wurden Affinitätskonstanten bekannter kompetitiver Agonisten bestimmt. Diese stimmten mit den Literaturwerten überein. Zur Erstellung neuer SAR-Daten wurden potenziell pharmakologisch aktive Substanzen in verschiedenen Konzentrationen getestet. Alle getesteten Substanzen wurden mit der Affinität der Bispyridiniumverbindung MB327 (pKi = 4,3 ± 0,2) verglichen. Diese diente ursprünglich als Leitsubstanz im CADD-Prozess zur Entwicklung neuartiger Therapeutika für die Behandlung von Nervenkampfstoffvergiftungen. Niessen et al. hatten gezeigt, dass MB327 die funktionelle Aktivität von nAChR wiederherstellen konnte, jedoch ein biphasisches pharmakologisches Profil aufwies. Einerseits war eine erwünschte modulierende Funktion am nAChR erkennbar, andererseits waren bei höheren Konzentrationen inhibitorische Effekte zu beobachten [2][3]. Daher ist die ­Testung potenzieller Wirkstoffkandidaten auf ihre Rezeptorfunktionalität von großer Bedeutung. Liganden-gesteuerte Ionenkanäle wie der nAChR können am besten mit Einzelkanalmessungen, die mittels bilayer basierter Elektrophysiologie durchgeführt werden, untersucht werden.

Die bilayer-basierte Elektrophysiologie setzt eine hohe Reinheit der verwendeten nAChR-haltigen Membranen voraus. Hierzu wurde eine affinitätschromatografische Methode entwickelt und etabliert. Hierbei konnte gezeigt werden, dass nur durch Einsatz entsprechender Detergenzien (hier: Natriumcholat) eine Aufreinigung des Rezeptors möglich war. Die Stärke der hydrophoben Wechselwirkungen zwischen der Transmembrandomäne des Rezeptors musste mittels Detergenz überwunden werden. Ergänzend wurde mittels L-α-Phosphatidylcholin (PC) in der Solubilisierungslösung eine stabilisierende Lipidumgebung für die extrahierten Proteine geschaffen. Der Versuch einer Affinitätsaufreinigung ohne Solubilisierung hatte keinen Erfolg gezeigt. Das gewonnene Material konnte zudem bereits erfolgreich über die Bildung von Proteoliposomen, d. h. dem Einschluss des Rezeptors in die Membran von Lipidkügelchen in artifizielle Membranen insertiert werden. Die Funktionspeaks nach Zugabe des Agonisten Carbamoylcholin zeigten sehr eindrucksvoll geschlossene und offene Zustände des nAChR (Abbildung 4) [4].

Abb. 4: Einzelkanalmessung am nikotinischen Acetylcholinrezeptor (Grafik erstellt mit BioRender; Bild Orbit TC Nanion GmbH, München)

Aufgereinigte nikotinische Acetylcholinrezeptoren wurden in eine künstliche Biolipidmembran eingebracht. Zur Erstellung dieser artifiziellen Membranen und Einzelkanalmessung wurde der Orbit e16 eingesetzt. Nach Zugabe des Agonisten Carbamoylcholin (etwa 30 µM) konnten spontane Öffnungsereignisse beobachtet werden. Allerdings zeigen die beobachteten Membranen in Abhängigkeit von der Güte des aufgereinigten Materials teilweise Instabilitäten des Lipidfilms sowie starke Temperaturabhängigkeiten. (Eigene Abbildung; Grafik erstellt mit BioRender; Orbit TC Nanion GmbH, München)

Diskussion

Die entwickelten Methoden zur Herstellung von Zellmembranfragmenten verschiedener Reinheitsstufen ermöglichen es, diverse Membranproteine als Zielstruktur pathogener Ereignisse zu untersuchen. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Hochdruckhomogenisierung sehr gut geeignet ist, die Dispersion und den Durchmesser von Vesikeln aus Zellmembranfragmenten zu minimieren und standardisieren. Dispersität, Zeta-Potential und Z-Durchmesser korrelierten direkt mit dem angewandten Druck. Die Ergebnisse zeigten, dass ein Druck von 400 bar während der Aufarbeitung für eine effiziente und gleichzeitig schonende Gewinnung von nAChR am besten geeignet war. Die bedarfsangepasste, weitgehend automatisierte Aufreinigung mittels Affinitätschromatografie und Gelfiltrationschromatografie sparte ­zudem wertvolle Zeit- und Materialressourcen. Die entwickelten Methoden zur Affinitäts- und Funktionalitätsuntersuchung am Rezeptor lieferten einen wichtigen Beitrag zu Struktur-Wirkungsbeziehungen, um die Datenbank für das CADD neuartiger Wirkstoffe für die Behandlung von Nervenkampfstoffvergiftungen zu ergänzen. Die vollautomatisierte Durchführung der Radioligand-Rezeptor-Bindungsassays ermöglichte auch erstmals Versuche in Gegenwart hochtoxischer Substanzen. Dies würde die Aufklärung weiterer Interaktionen potenzieller Therapeutika oder Toxine ermöglichen, was die Aussagen zu Struktur-Wirkungs-Beziehungen wesentlich erweitert. Die in dieser Arbeit entwickelten Methoden tragen wesentlich dazu bei, potenzielle Arzneimittelkandidaten bereits auf molekular-pharmakologischer Ebene zu entwickeln.

Literatur

1. Niessen KV, Seeger T, Rappenglück S et al.: In vitro pharmacological characterization of the bispyridinium non-oxime compound MB327 and its 2- and 3-regioisomers. Toxicology Letters 2018; 293: 190-197 mehr lesen
2. Niessen KV, Seeger T, Tattersall JEH et al.: Affinities of bispyridinium non-oxime compounds to (3)Hepibatidine binding sites of Torpedo californica nicotinic acetylcholine receptors depend on linker length. Chem Biol Interact 2013; 206(3): 545–554. mehr lesen
3. Springer F, Brüser A, Seeger T et al.: Affinitätsaufreinigung von nikotinischen Acetylcholinrezeptoren aus nativen mikrosomalen Zellmembranfragmenten von Tetronarce californica mittels immobilisiertem α-Bungarotoxin
4. Springer F, Freisleben M, Seeger T et al.: Hochdruckpräparation und Charakterisierung von mikrosomalen ­Zellmembranfragmenten zur Gewinnung von nAChR aus T. californica (Poster-Abstract). WMM 2022; 66(2-3); 82-84. mehr lesen
5. Unwin N: Nicotinic acetylcholine receptor and the structural basis of neuromuscular transmission: insights from Torpedo postsynaptic membranes. Q Rev Biophys 2013; 46 (4): 283-322 mehr lesen
6. Wein T, Wanner KT, Rappenglück S et al.: New Resensitizers for the Nicotinic Acetylcholine Receptor by Ligand-Based Pharmacophore Modeling. Curr Comput Aided Drug Des 2019; 15(1): 104-109. mehr lesen
7. Worek F, Thiermann H, Szinicz L, Eyer P: Kinetic analysis of interactions between human acetylcholinesterase, structurally different organophosphorus compounds and oximes. Biochemical Pharmacology 2004; 68(11): 2237–2248. mehr lesen

Verfasser

Leutnant (SanOA) Dipl.-Pharm. Fabian Springer, M.Sc., B.Sc.

Institut für Pharmakologie und Toxikologie der Bundeswehr

Neuherbergstr. 11, 80937 München

E-Mail: fabian1springer@bundeswehr.org

Der Vortrag belegte den 1. Platz beim Wettbewerb um den Heinz-Gerngroß-Förderpreis 2023 der Deutschen Gesellschaft für Wehrmedizin und Wehrpharmazie e. V.