Automatisierte Aufreinigungsmethoden und Screening-Assays für Interaktionen an der orthosterischen Bindungsstelle des nikotinischen Acetylcholinrezeptors

Fabian Springer^a,b, Marian Freisleben^a,c, Antonia Brüser^a, Thomas Seeger^a, Franz Worek^a, Lorenz Meinel^b, Karin Veronika Niessen^a

^a Institut für Pharmakologie und Toxikologie der Bundeswehr, München

^b Lehrstuhl für Pharmazeutische Technologie und Biopharmazie an der Julius-Maximilians-Universität Würzburg

^c Institut für Präzisionsmedizin an der Hochschule Furtwangen, Villingen-Schwenningen

Einleitung

Nervenkampfstoffe sind trotz internationaler Ächtung weiterhin eine potenzielle Bedrohung. Nach der präsynaptischen Ankunft eines Nervensignals wird der Neurotransmitter Acetylcholin (ACh) in den synaptischen Spalt freigesetzt. Dieser bindet an postsynaptische nikotinische Acetylcholinrezeptoren (nAChR), die damit eine Schlüsselrolle in der Signaltransduktion, insbesondere in der neuromuskulären Endplatte, besitzen. Die nAChR öffnen sich durch Bindung des Neurotransmitters ACh, was zum Einstrom von Natrium- bzw. Calciumionen entlang des elektrochemischen Gradienten in die Zelle führt. Dieser Ionenfluss verursacht eine Depolarisation der Zielzelle und führt letztendlich über mehrere Signalkaskaden zur Muskelkontraktion. Durch Abdiffusion und sofortigen Abbau durch das Enzym Acetylcholinesterase (AChE, 3.1.1.7) sinkt die Konzentration von ACh im synaptischen Spalt wieder. Die nAChR schließen sich [6].

Phosphororganische Verbindungen (organic phosphorous compounds, OPC) wie Nervenkampfstoffe hemmen die AChE. In Folge einer OPC-Intoxikation akkumuliert ACh im synaptischen Spalt. Ist der Rezeptor über eine längere Zeit erhöhten Konzentrationen an ACh ausgesetzt, wird der sogenannte desensitisierte Zustand, ein dysfunktionaler Rezeptorzustand stabilisiert. Charakteristisch für diesen Zustand ist, dass der Rezeptor geschlossen vorliegt und nicht mehr durch Agonisten aktivierbar ist [1]. Die derzeit etablierte Therapie adressiert die AChE in Form von Reaktivatoren (Obidoxim, Pralidoxim), unterstützt durch Benzodiazepine zur Behandlung der zentralnervösen Symptome. Antagonisten wie Atropin dämpfen die Wirkung des Ligandenüberschusses an den muskarinischen AChR (mAChR). Die Reaktivierung der durch Nervenkampfstoff gehemmten AChE ist nicht immer erfolgreich; insbesondere bei Soman-, Tabun- oder Novichok-Vergiftungen wird die Enzymfunktion nicht oder nur unzureichend wiederhergestellt [8]. Klinische Wirkstoffe, welche direkt mit dem nAChR interagieren und diesen wieder in einen funktionalen Zustand überführen, existieren derzeit nicht [2].

Computer Aided Drug Design (CADD) ist ein hocheffizientes Werkzeug zur Entwicklung von neuartigen pharmakologisch aktiven Verbindungen. In silico-Modellierung ermöglicht anhand von Structure-Activity-Rela­tionship (SAR)-Daten Vorhersagen zur biologischen Aktivität ausgehend von Leitsubstanzen. Die hierbei generierten Strukturvorschläge werden dann synthetisiert (sofern sie der Synthese zugänglich sind) und danach molekularpharmakologisch getestet. Es handelt sich also um einen iterativen Prozess: Molecular Modelling → Synthese → biologische bzw. pharmakologische Prüfung (Abbildung 1) [7].

Abb. 1: Iterativer Prozess zur Entwicklung neuer Wirkstoffe aus In silico-Modelling, Synthese und SAR-Datenbank.

Anhand der Structure-Activity-Relationship (SAR)-Daten kann die biologische und pharmakologische Aktivität von Substanzen vorhergesagt werden. Diese Daten können in der In silico-Modellierung zur Weiterentwicklung der Testsubstanzen genutzt werden. Entwickelte Substanzen werden anschließend synthetisiert und erneut getestet. Dieser iterative Prozess ermöglicht die zielgerichtete Verbesserung und Weiterentwicklung von pharmakologisch aktiven Substanzen. (Eigene Abbildung; Grafik erstellt mit BioRender; Orbit TC Nanion GmbH, München)

Zur Generierung von validen SAR-Daten für eine zielgerichtete Synthese ist die ständige Entwicklung geeigneter In-vitro-Testsysteme unabdingbar. Hierbei sind Daten zur Affinität an der orthosterischen Bindungsstelle sowie der Rezeptorfunktionalität von entscheidender Bedeutung.

Methodik

Die für Affinitäts- und Funktionalitätsassays benötigten Muskelsubtyp-nAChR wurden aus nativem Gewebe des Pazifischen Zitterrochens (Tetronarce californica, früher Torpedo californica) gewonnen. Aufgrund der phylogenetischen Entwicklung weist der nAChR einen hohen Grad an Homologie zwischen den Spezies und somit auch mit dem humanen Subtyp auf. Im Folgenden wird die Entwicklung von In-vitro-Modellsystemen zur Generierung von SAR-Daten vorgestellt.

1. Gewinnung von mikrosomalen Zellmembranfragmenten

Es wurde ein teilautomatisiertes skalierbares Hochdruck-Homogenisationsverfahren entwickelt. Hierbei erfolgte die Lysierung des tiefgefrorenen Gewebes mittels hyperosmolarer Pufferlösung und Scherkrafteinwirkung und die anschließende Reinigung der Zellmembranfragmente mittels Differenzialzentrifugation. Die Hochdruck-Homogenisation diente zum Aufschluss und zur homogenen Dispergierung des Materials. Die anschließende Charakterisierung erfolgte mittels Dynamic Light Scattering, Zeta-Potential-Messung, Bicinchoninsäure-Assay und Lichtmikroskopie [5].

2. Entwicklung eines Radioliganden-Bindungs­assays in einem neuen Format (Sättigungs- und Kompetitionsassay)

Nach dem Prinzip eines klassischen Radioliganden-Bindungsassays wurde ein spezieller Affinitätsassay entwickelt, der neben radioaktiven Substanzen auch den Einsatz hochtoxischer Verbindungen erlaubt. Dieser folgt dem Prinzip eines Scintillation Proximity Assays (SPA). Hierbei wurden die zuvor erzeugten rezeptorhaltigen Membranfragmente auf Beads, die in ihrem Inneren einen Szintillator enthielten, inkubiert. Der mit Tritium markierte nAChR-Agonist [³H]Epibatidin diente als Marker für die Affinität an der orthosterischen Bindungsstelle. Abhängig von der Affinität einer Testsubstanz wurde [³H]Epibatidin aus seiner Bindungsstelle verdrängt. Mit Hilfe des Szintillators konnte diese Verdrängung nachgewiesen werden. Der Wendepunkt der ermittelten Verdrängungskurve wird als mittlere inhibitorische Konstante (K_i) bezeichnet. Diese ist ein Maß für die Bindungsstärke der Testsubstanz. Anhand der berechneten Sättigungsisotherme können die Affinitätskonstante K_D und die maximale Anzahl an Bindungsstellen B_max ermittelt werden. Darauf aufbauend wurden Kompetitionsassays zur Ermittlung von Affinitätskennzahlen pK_i durchgeführt.

3. Weiterentwicklung der Rezeptoraufreinigung mittels Affinitätschromatografie

nAChR-haltige mikrosomale Membranfragmente wurden durch Zusatz eines Detergenz solubilisiert. Die aus der nativen Lipidumgebung herausgelösten Transmembranproteine wurden durch den Zusatz weiterer Lipide in der wässrigen Phase stabilisiert. Die Aufreinigung erfolgte mittels Affinitätschromatografie. Hierbei wurden die solubilisierten nAChR an den nAChR-Antagonist α-Bungarotoxin, der an die stationäre Phase gekoppelt wurde, gebunden. Weitere solubilisierte Proteine gingen keine Ligand-­Rezeptor-Interaktion ein und wurden von der Säule gewaschen. Um die an der stationären Phase gebundenen nAChR-haltigen Membranfragmente zu gewinnen, wurden mittels eines hochmolaren Zusatzes des nAChR-Agonisten Carbamoylcholin die nAChR vom α-Bungarotoxin abgelöst und als nAChR-Carbamoylcholin-Komplex eluiert. Die erhaltenen Fraktionen wurden im Anschluss mittels Gelelektro­phorese und Immunoblotting gegen ein nAChR-haltiges Referenzmaterial charakterisiert [4].

Ergebnisse

Die neu entwickelte Hochdruck-Homogenisationsmethode ermöglichte die Herstellung hoch standardisierter Zellmembranfragmente. Zur Ermittlung des optimalen Drucks wurden im Vorfeld verschiedenen Drücke (200–1 200 bar) getestet. Der Polydispersitätsindex (P_i, ein Maß der Partikelgrößenverteilung) sowie der hydrodynamische Durchmesser (Z_avg) wurden in Korrelation mit dem angewandten Druck minimiert, wobei initial die stärkste Abnahme der Startwerte zu beobachten war. Interessanterweise war die Laufzeit der Homogenisierungsläufe bei höheren Drücken nicht länger als bei niedrigeren Drücken. Allerdings stieg gerade bei höheren Drücken die Temperatur mit jeder Passage an (Abbildung 2).

Abb. 2: Temperaturentwicklung nach Homogenisationszyklus und angewendetem Druck.

Die Temperaturentwicklung zeigt eine deutliche Zunahme der Temperatur in Abhängigkeit von der Anzahl der Homogenisationszyklen (Anzahl der Passagen). Diese Temperaturzunahme trägt zu einer Destabilisierung der Rezeptorintegrität sowie einer Erhöhung der Membranfluidität bei. (Eigene Abbildung; AVP-2000 SPXflow-Technology, Moers)

Bereits nach fünf Homogenisationszyklen waren P_i und Z_avg stabil. Mehr Passagen brachten keinen Benefit, sondern waren eher kontraproduktiv, weil sie zu einer starken Degradation der nAChR führten (Abbildung 3). Die Proteinkonzentration, die photometrisch mittels Bicinchoninsäure-Assay als zusätzliches Qualitätskriterium bestimmt wurde, blieb durchgehend stabil. Zudem konnte das teilautomatisierte Verfahren die Chargenvarianz gegenüber der manuellen Aufarbeitung deutlich minimieren [5].

Abb. 3:Lichtmikroskopische Abbildungen (20-fache Vergrößerung, Hellfeld) der nAChR enthaltenden Zellmembranfragmente. Die Abbildungen zeigen den Zustand nach manueller Aufarbeitung mittels Dounce-Homogenisation sowie teilautomatisierter Hochdruckhomogenisation bei 400 bar und 1 000 bar. Die zugehörigen Sättigungsisotherme mit [³H]Epibatidin zeigen die Korrelation zwischen Druck und Rezeptorbeschaffenheit. So kann an der Abnahme von B_Max bei höherem Druck eine deutliche Degradation der nAChR festgemacht werden. (Eigene Abbildung; Grafik erstellt mit BioRender)

Der neuentwickelte SPA wurde auf einer temperaturkontrollierten automatisierten, modularen Pipettier- und Inkubierplattform etabliert. Dies reduzierte die Kontamination mit radioaktivem und toxischem Material auf ein Minimum. Im Sättigungsassay konnte eine Absättigung nahezu aller Bindungsstellen gezeigt werden, wenn 50 nM [³H]Epibatidin bei 2,5 µg rezeptorhaltigen Membranfragementen eingesetzt werden.

Zusätzlich wurde der SPA gemäß den Kriterien der European Medical Agency (EMA) sowie der Food and Drug Administration (FDA) in den Bereichen Präzision und Lösemittelbeständigkeit teilvalidiert. Zur Methodenverifikation wurden Affinitätskonstanten bekannter kompetitiver Agonisten bestimmt. Diese stimmten mit den Literaturwerten überein. Zur Erstellung neuer SAR-Daten wurden potenziell pharmakologisch aktive Substanzen in verschiedenen Konzentrationen getestet. Alle getesteten Substanzen wurden mit der Affinität der Bispyridiniumverbindung MB327 (pKi = 4,3 ± 0,2) verglichen. Diese diente ursprünglich als Leitsubstanz im CADD-Prozess zur Entwicklung neuartiger Therapeutika für die Behandlung von Nervenkampfstoffvergiftungen. Niessen et al. hatten gezeigt, dass MB327 die funktionelle Aktivität von nAChR wiederherstellen konnte, jedoch ein biphasisches pharmakologisches Profil aufwies. Einerseits war eine erwünschte modulierende Funktion am nAChR erkennbar, andererseits waren bei höheren Konzentrationen inhibitorische Effekte zu beobachten [2][3]. Daher ist die ­Testung potenzieller Wirkstoffkandidaten auf ihre Rezeptorfunktionalität von großer Bedeutung. Liganden-gesteuerte Ionenkanäle wie der nAChR können am besten mit Einzelkanalmessungen, die mittels bilayer basierter Elektrophysiologie durchgeführt werden, untersucht werden.

Die bilayer-basierte Elektrophysiologie setzt eine hohe Reinheit der verwendeten nAChR-haltigen Membranen voraus. Hierzu wurde eine affinitätschromatografische Methode entwickelt und etabliert. Hierbei konnte gezeigt werden, dass nur durch Einsatz entsprechender Detergenzien (hier: Natriumcholat) eine Aufreinigung des Rezeptors möglich war. Die Stärke der hydrophoben Wechselwirkungen zwischen der Transmembrandomäne des Rezeptors musste mittels Detergenz überwunden werden. Ergänzend wurde mittels L-α-Phosphatidylcholin (PC) in der Solubilisierungslösung eine stabilisierende Lipidumgebung für die extrahierten Proteine geschaffen. Der Versuch einer Affinitätsaufreinigung ohne Solubilisierung hatte keinen Erfolg gezeigt. Das gewonnene Material konnte zudem bereits erfolgreich über die Bildung von Proteoliposomen, d. h. dem Einschluss des Rezeptors in die Membran von Lipidkügelchen in artifizielle Membranen insertiert werden. Die Funktionspeaks nach Zugabe des Agonisten Carbamoylcholin zeigten sehr eindrucksvoll geschlossene und offene Zustände des nAChR (Abbildung 4) [4].

Abb. 4: Einzelkanalmessung am nikotinischen Acetylcholinrezeptor (Grafik erstellt mit BioRender; Bild Orbit TC Nanion GmbH, München)

Aufgereinigte nikotinische Acetylcholinrezeptoren wurden in eine künstliche Biolipidmembran eingebracht. Zur Erstellung dieser artifiziellen Membranen und Einzelkanalmessung wurde der Orbit e16 eingesetzt. Nach Zugabe des Agonisten Carbamoylcholin (etwa 30 µM) konnten spontane Öffnungsereignisse beobachtet werden. Allerdings zeigen die beobachteten Membranen in Abhängigkeit von der Güte des aufgereinigten Materials teilweise Instabilitäten des Lipidfilms sowie starke Temperaturabhängigkeiten. (Eigene Abbildung; Grafik erstellt mit BioRender; Orbit TC Nanion GmbH, München)

Diskussion

Die entwickelten Methoden zur Herstellung von Zellmembranfragmenten verschiedener Reinheitsstufen ermöglichen es, diverse Membranproteine als Zielstruktur pathogener Ereignisse zu untersuchen. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Hochdruckhomogenisierung sehr gut geeignet ist, die Dispersion und den Durchmesser von Vesikeln aus Zellmembranfragmenten zu minimieren und standardisieren. Dispersität, Zeta-Potential und Z-Durchmesser korrelierten direkt mit dem angewandten Druck. Die Ergebnisse zeigten, dass ein Druck von 400 bar während der Aufarbeitung für eine effiziente und gleichzeitig schonende Gewinnung von nAChR am besten geeignet war. Die bedarfsangepasste, weitgehend automatisierte Aufreinigung mittels Affinitätschromatografie und Gelfiltrationschromatografie sparte ­zudem wertvolle Zeit- und Materialressourcen. Die entwickelten Methoden zur Affinitäts- und Funktionalitätsuntersuchung am Rezeptor lieferten einen wichtigen Beitrag zu Struktur-Wirkungsbeziehungen, um die Datenbank für das CADD neuartiger Wirkstoffe für die Behandlung von Nervenkampfstoffvergiftungen zu ergänzen. Die vollautomatisierte Durchführung der Radioligand-Rezeptor-Bindungsassays ermöglichte auch erstmals Versuche in Gegenwart hochtoxischer Substanzen. Dies würde die Aufklärung weiterer Interaktionen potenzieller Therapeutika oder Toxine ermöglichen, was die Aussagen zu Struktur-Wirkungs-Beziehungen wesentlich erweitert. Die in dieser Arbeit entwickelten Methoden tragen wesentlich dazu bei, potenzielle Arzneimittelkandidaten bereits auf molekular-pharmakologischer Ebene zu entwickeln.

Literatur

1. Niessen KV, Seeger T, Rappenglück S et al.: In vitro pharmacological characterization of the bispyridinium non-oxime compound MB327 and its 2- and 3-regioisomers. Toxicology Letters 2018; 293: 190-197 mehr lesen
2. Niessen KV, Seeger T, Tattersall JEH et al.: Affinities of bispyridinium non-oxime compounds to (3)Hepibatidine binding sites of Torpedo californica nicotinic acetylcholine receptors depend on linker length. Chem Biol Interact 2013; 206(3): 545–554. mehr lesen
3. Springer F, Brüser A, Seeger T et al.: Affinitätsaufreinigung von nikotinischen Acetylcholinrezeptoren aus nativen mikrosomalen Zellmembranfragmenten von Tetronarce californica mittels immobilisiertem α-Bungarotoxin
4. Springer F, Freisleben M, Seeger T et al.: Hochdruckpräparation und Charakterisierung von mikrosomalen ­Zellmembranfragmenten zur Gewinnung von nAChR aus T. californica (Poster-Abstract). WMM 2022; 66(2-3); 82-84. mehr lesen
5. Unwin N: Nicotinic acetylcholine receptor and the structural basis of neuromuscular transmission: insights from Torpedo postsynaptic membranes. Q Rev Biophys 2013; 46 (4): 283-322 mehr lesen
6. Wein T, Wanner KT, Rappenglück S et al.: New Resensitizers for the Nicotinic Acetylcholine Receptor by Ligand-Based Pharmacophore Modeling. Curr Comput Aided Drug Des 2019; 15(1): 104-109. mehr lesen
7. Worek F, Thiermann H, Szinicz L, Eyer P: Kinetic analysis of interactions between human acetylcholinesterase, structurally different organophosphorus compounds and oximes. Biochemical Pharmacology 2004; 68(11): 2237–2248. mehr lesen

Verfasser

Leutnant (SanOA) Dipl.-Pharm. Fabian Springer, M.Sc., B.Sc.

Institut für Pharmakologie und Toxikologie der Bundeswehr

Neuherbergstr. 11, 80937 München

E-Mail: fabian1springer@bundeswehr.org

Der Vortrag belegte den 1. Platz beim Wettbewerb um den Heinz-Gerngroß-Förderpreis 2023 der Deutschen Gesellschaft für Wehrmedizin und Wehrpharmazie e. V.

Intraoperativ-geformte (Palacos^®) versus CAD-CAM-PMMA-Kranioplastiken nach (dekompressiver) Kraniektomie: Eine retrospektive Single-Center-Analyse von 359 Fällen

Hädrich D^{a, b}, Lilla N^{b, c}, Ernestus R-I^b, Westermaier T^b

^a Bundeswehrzentralkrankenhaus Koblenz KlinikIV – Augenheilkunde

^b Universitätsklinik Würzburg, Neurochirurgische Klinik und Poliklinik

^c Universitätsklinik Magdeburg, Neurochirurgische Klinik

Hintergrund und Wehrmedizinische Relevanz

Im aktuellen russischen Angriffskrieg in der Ukraine wird über eine Rate von ca. 35 % Schädel- und Nackenverletzungen berichtet [18]. Nach ballistischer oder explosionsassoziierter Einwirkung am Schädel kann in der Folge eine dekompressive Kraniektomie erforderlich werden. In den US-amerikanischen Einsätzen im Irak und in Afghanistan war dies der führende neurochirurgische Eingriff im Bereich der Role 2 und Role 3 mit insgesamt 1 704 Kraniektomien [20].

Die Kranioplastik (auch Schädeldachplastik) ist ein neurochirurgisches Verfahren, welches die Funktionalität und Ästhetik des Patientenschädels nach der Kraniektomie wiederherstellt. Die Deckung des entstandenen Knochendefektes ist wichtig, weil dadurch der zerebrale Metabolismus verbessert, das „Syndrome of the trephined“ or „sinking skin flap syndrome“ verhindert und die soziale und neurologische Rehabilitation ermöglicht werden kann [9].

Wenn der autologe Knochendeckel nicht mehr verwendet (z. B. durch Zerstörung oder Verlust) oder nicht ausreichend konserviert werden kann (Kryokonservierung bei -80°C), können alloplastische Materialien zur Deckung genutzt werden. Hierbei werden insbesondere Polyetheretherketon (PEEK), Hydroxylapatit, Titan oder Polymethylmethacrylat (PMMA) im klinischen Alltag verwendet [22]. PMMA kommt bereits seit den 1950er-Jahren als alloplastisches Material bei Kranioplastiken zum Einsatz [1], jedoch zumeist als intraoperativ freihand-gefertigtes Implantat mittels Palacos^®-Knochenzement. Neben hohen Komplikationsraten bei Kranioplastiken allgemein [2], wird insbesondere bei den intraoperativ-gefertigten Palacos^®-PMMA-Implantaten von einem unbefriedigenden subjektiven ästhetischen Ergebnis berichtet [5]. Daher gibt es seit den 1990er-Jahren eine intensive Forschung an patientenspezifischen, 3D-konstruierten Implantaten. Diese Technik, auch als CAD-CAM (Computer-Aided Design, Computer-Aided Manufacturing) bezeichnet, kann die Wiedergabe der natürlichen Schädelkontur ermöglichen [16].

Im Vorfeld der Operation wird eine Dünnschicht-Computertomografie (CT) des Schädels inklusive des Schädeldefektes durchgeführt, dieses in eine Software ein­gepflegt und der Defekt mittels Implantats gedeckt (Abbildung 1). Mit verschiedenen präoperativen Optionen (z. B. Vorverplattung des Implantats, siehe Abbildung 2) kann eine Optimierung des Operationsergebnisses erreicht werden [17].

Abb. 1: Bild a und b: Rekonstruktion des Defektes und Erstellung des Implantats mittels Software [14]; rechtes Bild: Stereolithografiemodell (Bildquelle: Autor)

Die Fragestellung der Studie besteht darin, inwiefern die CAD-CAM-PMMA-Implantate den Palacos®-Implantaten hinsichtlich eingriffsbezogener, ökonomischer und ästhetischer Ergebnisse überlegen ist. Zur Beantwortung dieser Fragestellung wurden in der vorliegenden Studie beide Implantate im Hinblick auf perioperative Modalitäten, kurz- und langfristige Komplikationsraten und ästhetische Ergebnisse verglichen.

Methoden

Die Studie ist als retrospektive Single-Center-Analyse konzipiert und umfasst 350 Patienten mit insgesamt 359 Kranioplastiken zwischen 2005 und 2018, die in der Neurochirurgischen Klinik und Poliklinik der Universitätsklinik Würzburg operiert wurden. Palacos^®-Patienten (n = 133) erhielten zwischen 2005 und 2012 eine Kranioplastik. Den CAD-CAM-Patienten (n = 226) wurden zwischen 2010 und 2018 ein Implantat der Firma Zimmer Biomet GmbH (Freiburg i. B.) eingesetzt. Die Krankenakten wurden retrospektiv ausgewertet und umfassten demografische Daten, patientenspezifische Risikofaktoren und Vorerkrankungen, Daten zur Kranioplastik (Größe, Ort), chirurgische Daten sowie postoperative Komplikationen. Diese postoperativen Komplikationen wurden nach der Erforderlichkeit einer Revisions-Operation in kurzfristige (< 30 Tage) und langfristige (> 30 Tage) Komplikationen unterteilt. Die Größe des Defekts wurde bei fehlender Dokumentation anhand der Ellipsenformel Fläche A = π*(a/2)*(b/2) (a = Hälfte der maximalen kranio-kaudalen Ausbreitung, b = Hälfte der maximalen rostro-dorsalen Ausbreitung) berechnet.

Abb. 2: Intraoperativer Situs: rechts: Wiedereröffneter Kraniektomiedefekt, links: Deckung des Defekts mittels vorverplatteten CAD-CAM-Implantats (Bildquelle: Autor)

Grundsätzlich wurden alle Patienten, die im genannten Zeitraum eine Kranioplastik erhielten, und jedes Implantat in die Analyse einbezogen und als einzelner Fall gezählt. Eine Ausnahme bildete ein Revisionsimplantat. Es wurden keine Einschränkungen hinsichtlich des Patientenalters, der minimalen oder maximalen Größe des Schädeldefekts oder Vorerkrankungen festgelegt. Bei einem einzeitigen Vorgehen musste die Operationsdauer ausgeschlossen werden, da eine Differenzierung in Kraniektomie und Kranioplastik nicht möglich war.

Die ästhetischen Ergebnisse der Kranioplastiken wurden per Telefoninterview evaluiert. Hierfür wurde ein Fragebogen zur Erhebung der subjektiven Zufriedenheit mit dem ästhetischen Ergebnis erstellt. Die Patienten wurden über das Forschungsprojekt informiert und um eine schriftliche Einverständniserklärung ersucht. Anschließend wurden sie gebeten, das subjektive ästhetische Ergebnis auf einer 5-Punkte-Skala zu bewerten: „sehr unzufrieden“ (1 Punkt), „unzufrieden“ (2 Punkte), „teilweise zufrieden“ (3 Punkte), „zufrieden“ (4 Punkte) und zum Zeitpunkt der Befragung „sehr zufrieden“ (5 Punkte).

Die Auswertung aller beschriebenen Daten erfolgte nach Prüfung und Zustimmung durch die Ethikkommission der Universität Würzburg mit dem Aktenzeichen 20200205 03.

Ergebnisse

Das Studienkollektiv unterteilt sich in 63,1 % (n = 226) CAD-CAM-PMMA-Implantate und 36,9 % (n = 133) Palacos^®-Implantate. Palacos^®-Patienten (60,2 % Männer, 39,8 % Frauen) und CAD-CAM-Patienten (59,7 % Männer, 40,3 % Frauen) erhielten eine Kranioplastik mehrheitlich aufgrund eines vorangegangenen Schädel-Hirn-Traumas. Das mittlere Intervall zwischen Kraniektomie und Kranioplastik war bei beiden Implantatgruppen ähnlich (Palacos^®: 110 Tage, CAD-CAM: 105 Tage). In beiden Gruppen war die Kranioplastik am häufigsten rechtshemisphärisch und hatte eine durchschnittliche Größe von 75,46 ± 26,12 cm² (Palacos^®) und 90,87± 32,26 cm² (CAD-CAM).

Hinsichtlich der operativen Parameter zeigten sich für beide Implantate unterschiedliche Ergebnisse.
CAD-CAM-Patienten (145,10 ± 45,27min) hatten eine signifikant (p < 0.001) kürzere Operationszeit als Palacos^®-­Patienten (199,00 ± 80,23 min). Auch der intraoperative Blutverlust bei CAD-CAM-Implantaten (300,55 ± 220,67 ml) war signifikant (p < 0.001) geringer als in der Palacos^®-Gruppe. Zudem hatten CAD-CAM-Patienten (7,57 ± 4,26 Tage) im Vergleich zu Palacos^®-Patienten (8,70 ± 4,35 Tage) einen signifikant kürzeren (p < 0.001) postoperativen Krankenhausaufenthalt.

Operative Revisionen traten bei CAD-CAM-Implantaten weniger häufig auf (12,8 % vs. 15,8 %). Im Kurzzeitverlauf (< 30 Tage) war der Hauptgrund dafür in beiden Gruppen ein epidurales Hämatom mit gleichen Anteilen (5,8 %). Im Langzeitverlauf (>30 Tage) zeigten sich Unterschiede zwischen beiden Gruppen. Bei Palacos^®-Patienten ereigneten sich im Vergleich zu CAD-CAM signifikant häufiger Implantatdislokationen (p < 0.001).

Postoperative Infektionen traten in 3,8 % der Palacos^®-Fälle und nur in 1,8 % der CAD-CAM-Fälle auf. Allerdings zeigten sich bei CAD-CAM-Patienten signifikant (p < 0.001) mehr postoperative revisionsbedürftige Wundheilungsstörungen (WHS). Im Kontext dieser WHS waren insgesamt signifikant mehr kranielle Voroperationen bzw. Wiedereröffnungen des Hautschnittes bei CAD-CAM-Patienten zu sehen (p < 0.01). Im Vergleich zur Gruppe der Palacos^®-Patienten zeigte insbesondere das CAD-CAM-Kollektiv mit WHS nahezu doppelt so viele Wiedereröffnungen des kraniellen Hautschnittes (Abbildung 3).

Abb. 3: Boxplot zum Vergleich der Anzahl der Wiedereröffnungen des kraniellen Hautschnittes: Die Patienten mit WHS zeigten nahezu doppelt so viele Wiedereröffnungen als Palacos^®-Patienten.

Bei CAD-CAM-Patienten zeigten sich zudem signifikant (p < 0.05) weniger nicht-revisionspflichtige Komplikationen (z. B. Wundpolster, Liquorpolster).

Das ästhetische Ergebnis konnte bei 27,8 % (n = 37) der Palacos^®-Patienten und 25,2 % (n = 57) der CAD-CAM-Fälle beurteilt werden. Palacos^®-Patienten (M = 3,97, SD = 1,28) waren im Durchschnitt etwas weniger zufrieden als CAD-CAM-Patienten (M = 4,23, SD = 1,00), obwohl beide Gruppen das ästhetische Ergebnis als „zufrieden“ bewerteten. Es konnte kein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Implantatgruppen nachgewiesen werden (p > 0.05).

Diskussion

Die vorliegende Studie ist die derzeit weltweit größte Single-Center-Studie zum Vergleich von freihand-modellierten Palacos^®- und CAD-CAM-PMMA-Kranioplastiken. Wir konnten für CAD-CAM-Implantate im Vergleich zu Palacos^®-Implantaten überlegene Ergebnisse im Bereich der intra- und postoperativen Parameter zeigen, die zum Teil hochsignifikant waren.

Operationszeit/Blutverlust/stationäre Behandlungsdauer

Die signifikant kürzere Operationszeit und der signifikant geringere intraoperative Blutverlust bei CAD-CAM-Patienten konnten in einigen Studien bereits gezeigt werden, jedoch anhand deutlich geringerer Fallzahlen [16].

Generell können die präoperative Anfertigung, die Möglichkeit der Vorverplattung der Implantate und ein vereinfachter Insertionsprozess als mögliche Gründe für die kürzere Operationszeit angesehen werden [17].

Ein weiteres wichtiges Ergebnis unserer Arbeit war die signifikant kürzere postoperative Hospitalisierung von CAD-CAM-Patienten im Vergleich zu Palacos®-Patienten. Eine Erklärung könnte die schnellere allgemeine und neurologische Rehabilitation der Patienten mit vorgefertigten Implantaten sein [4].

Komplikationsraten

Ein Schwerpunkt unserer Studie war der Vergleich hinsichtlich Kurz- und Langzeitkomplikationen. Allgemeine Komplikationsraten für Kranioplastiken liegen im Bereich zwischen 12 % und 50 % [3][8]. Wir zeigten bei beiden Implantaten eine Komplikationsrate im unteren Bereich, wenngleich CAD-CAM-Implantate weniger revisionspflichtige Komplikationen aufwiesen (12,8 %). In den meisten Studien wird nicht zwischen intraoperativ-geformten und präoperativ-hergestellten PMMA-Kunststoffen unterschieden [6], was die Vergleichbarkeit der Ergebnisse erschwert. Mögliche Faktoren, die die postoperativen Komplikationen beeinflussen, wie z. B. die Grunderkrankung des Patienten, das Alter des Patienten, das Operationsverfahren, die Erfahrung des Chirurgen oder bestimmte Indikationen für eine Kranioplastik, konnten in unserer Studie nicht nachgewiesen werden.

CAD-CAM-Patienten waren mit 1,8 % weniger anfällig für postoperative Infektionen als Palacos^®-Patienten mit 3,8 %. In der Literatur werden zwischen 6 % und 11 % Infektionen für intraoperativ-geformte PMMA-Implantate und 7 % für CAD-CAM-PMMA-Implantate angegeben [15][21]. Im Vergleich zu diesen Studien sind die Infektionsraten für beide Implantate in unserer Studie sehr niedrig.

Eine Erklärung für die geringere Infektionstendenz bei CAD-CAM-Implantaten könnte ihre poröse Struktur sein, die das Einwachsen in das umliegende Gewebe und die Penetration von Gefäßen ermöglicht und unterstützt. Darüber hinaus hat das CAD-CAM-Implantat eine negative Oberflächenspannung, die eine Anhaftung von Bakterien verhindert. In der Literatur werden auch patientenspezifische Merkmale als Einflussfaktoren für Infektionen diskutiert. Insgesamt konnten wir keine patientenspezifischen Faktoren identifizieren, die die Infektionsrate beeinflussen.

Im Langzeitverlauf fanden sich signifikant (p < 0.001) mehr WHS bei CAD-CAM-Kranioplastiken. Die Studienlage hierzu ist nicht eindeutig [7][12]. In unserer Studie lässt sich die erhöhte Anzahl von WHS bei CAD-CAM-Implantaten durch die stark erhöhte Anzahl von kraniellen Voroperationen bzw. Wiedereröffnungen des kraniellen Hautschnittes in dieser Gruppe erklären. Die mehrfachen Wiedereröffnungen des vorangegangenen Hautschnittes könnten zu WHS prädisponiert haben. Eine weitere Ursache könnte sein, dass die CAD-CAM-Implantate aufgrund der besseren Nachbildung der natürlichen Schädelkontur mehr Spannung auf der Haut erzeugten als Palacos®- Implantate. Ebenso könnte die deutlich größere Implantatgröße bei CAD-CAM im Vergleich zu Palacos® zu einer größeren Wundfläche oder Naht und einem entsprechend erhöhten Risiko für WHS geführt haben.

In der vorliegenden Studie zeigten die Palacos^®-Implantate signifikant (p < 0.001) mehr postoperative Dislokationen im Langzeitverlauf als CAD-CAM-Implantate. Dies entspricht den Ergebnissen weiterer Studien [21]. Ein Grund für die Dislokationstendenz bei Palacos^® könnte die verstärkte Freisetzung von Sauerstoffradikalen im Rahmen des Polymerisationsprozesses sein, welches zu Mikrobewegungen zwischen Material und Knochen führt [19]. Weiterhin kann das Material während des Aushärtungsprozesses schrumpfen [13].

Postoperative Ästhetik

Hinsichtlich der postoperativen Ästhetik zeigten sich bei den CAD-CAM-Implantaten bessere Ergebnisse als bei Palacos^®-Implantaten. Die Literaturrecherche ließ ein signifikant besseres Ergebnis zugunsten der CAD-CAM-Implantate erwarten, da vor allem die Freihand-Modellierung mit schlechteren ästhetischen Ergebnissen einherzugehen scheint [10]. Dies konnte in unserer Studie nicht bestätigt werden. Ein Grund dafür könnte die niedrige Anzahl an befragten Patienten sein. Zudem gibt es bis jetzt kein wissenschaftlich anerkanntes und geeignetes Messinstrument zur Bestimmung des ästhetischen und funktionellen Ergebnisses, das validiert ist und standardisiert angewendet werden kann [11]. Die Implementierung eines solchen Messinstruments ist neben der Erhöhung der Anzahl der befragten Patienten das Ziel weiterer Forschung, um aussagekräftige Ergebnisse und eine Vergleichbarkeit der Studien zu erreichen.

Fazit

Diese Studie zeigt eine Überlegenheit der CAD-CAM-Implantate gegenüber Palacos^®-Implantaten hinsichtlich peri- und postoperativen sowie ästhetischen Ergebnissen. Insbesondere die kürzere Operationszeit, die kürzere Hospitalisierung, der geringere intraoperative Blutverlust und der klare Trend für eine höhere Zufriedenheit mit dem ästhetischen Ergebnis spricht für die Verwendung der CAD-CAM-PMMA-Implantate. Zudem haben CAD-CAM-Implantate eine geringere Infektionsrate als Palacos^®-Implantate und zeigten positive Effekte, wenn sie in vorinfiziertes Gewebe implantiert wurden. Somit könnte die Nutzung von CAD-CAM-PMMA-Implantaten im klinischen Alltag bei Patienten nach Kraniektomie zu einer optimalen und langfristigen Versorgung beitragen. Weitere Studien sind jedoch erforderlich, um die langfristigen Komplikationsraten, insbesondere bei CAD-CAM-Implantaten, zu bewerten und die Stichprobengröße der Befragung zu erhöhen, um die Resultate im ästhetischen Ergebnis zu bestätigen.

Literatur

1. Bobinski L, Koskinen LO, Lindvall P: Complications following cranioplasty using autologous bone or polymethylmethacrylate--retrospective experience from a single center. Clin Neurol Neurosurg 2013; 115(9): 1788-1791. mehr lesen
2. Chang V, Hartzfeld P, Langlois M, et al: Outcomes of cranial repair after craniectomy. J Neurosurg 2010; 112(5):1120–1124. mehr lesen
3. Dean D, Min KJ, Bond A: Computer aided design of large-format prefabricated cranial plates. J Craniofac Surg 2003; 14(6): 819-832. mehr lesen
4. Eufinger H, Wehmöller M, Machtens E, et al: Reconstruction of craniofacial bone defects with individual alloplastic implants based on CAD/CAM-manipulated CT-data. J Craniomaxillofac Surg 1995 ;23(3): 175–181. mehr lesen
5. Fernandez de Grado G, Keller L, Idoux-Gillet Y, et al: Bone substitutes: a review of their characteristics, clinical use, and perspectives for large bone defects management. J TissEngin 2018; 9: 2041731418776819. mehr lesen
6. Giese H, Meyer J, Engel M, et al: Polymethylmethacrylate patient-matched implants (PMMA-PMI) for complex and revision cranioplasty: analysis of long-term complication rates and patient outcomes. Brain Inj 2020; 34(2): 269-275. mehr lesen
7. Gooch MR, Gin GE, Kenning TJ, German JW: Complications of cranioplasty following decompressive craniectomy: analysis of 62 cases. Neurosurg Focus 2009; 26(6): E9. mehr lesen
8. Halani SH, Chu JK, Malcolm JG, al: Effects of cranioplasty on cerebral blood flow following decompressive cranial surgery: A systematic review of the literature. Neurosurgery 2017; 81(2): 204–216. mehr lesen
9. Han SE, Lim SY, Pyon JK et al: Refinement of secondary cranioplasty using methyl methacrylate bone cements. Aesthetic Plast Surg 2013; 37(3): 592-600. mehr lesen
10. Henker C, Hoppmann M-C, Sherman MUS, et al: Validation of a novel clinical ccore: The Rostock functional and cosmetic cranioplasty (RFCC-) score. J Neurotrauma 2018 Apr 15; 35(8): 1030-1036. mehr lesen
11. Höhne J, Werzmirzowsky K, Ott C, et al: Outcomes of cranioplasty with preformed titanium versus freehand molded polymethylmethacrylate implants. J Neurol Surg A Cent Eur Neurosurg 2018 May; 79(3): 200-205. mehr lesen
12. Jaberi J, Gambrell K, Tiwana P, Madden C, Finn R:. Long-term clinical outcome analysis of poly-methyl-methacrylate cranioplasty for large skull defects. J Oral Maxillofac Surg 2013; 71(2): e81-8. mehr lesen
13. König A, Spetzger U. Rekonstruktive operative Verfahren nach Schädel-Hirn-Trauma. Neurochirurgische Therapie des Schädel-Hirn-Traumas: Operative Akutversorgung und rekonstruktive Verfahren. Berlin, Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg; 2019: 93-107.
14. Kwarcinski J, Boughton P, Ruys A, et al: Cranioplasty and Craniofacial Reconstruction: A Review of Implant Material, Manufacturing Method and Infection Risk. Applied Sciences 2017; 7(3): 276. mehr lesen
15. Lee S-C, Wu C-T, Lee S-T, Chen P-J:. Cranioplasty using polymethyl methacrylate prostheses. J Clin Neurosci 2009; 16(1): 56–63. mehr lesen
16. Nout E, Mommaerts MY: Considerations in computer-aided design for inlay cranioplasty: technical note. Oral Maxillofac Surg 2018; 22(1): 65–69. mehr lesen
17. Ostashchenko T: The current situation and challenges to medical support due to the full-scale aggression of the russian federation in ukraine. 31.May 2022.
18. Pikis S, Goldstein J, Spektor S: Potential neurotoxic effects of polymethylmethacrylate during cranioplasty. J Clin Neurosci 2015; 22(1): 139-143. mehr lesen
19. Turner CA, Stockinger ZT, Bell RS, Gurney JM: Neurosurgical workload during US combat operations: 2002 to 2016. J Trauma Acute Care Surg 2018; 85(1): 140-147. mehr lesen
20. Vince GH, Kraschl J, Rauter H, et al: Comparison between autologous bone grafts and acrylic (PMMA) implants - A retrospective analysis of 286 cranioplasty procedures. J Clin Neurosci 2019; 61: 205-259. mehr lesen
21. Zanotti B, Zingaretti N, Verlicchi A, et al: Cranioplasty: Review of Materials. J Craniofac Surg 2016; 27(8): 2061-2072. mehr lesen

Verfasser

Stabsarzt Dr. Dustin Hädrich

Bundeswehrzentalkrankenhaus Koblenz

Klinik IV – Augenheilkunde

Rübenacher Str. 170, 56072 Koblenz

E-Mail: dustinhaedrich@bundeswehr.org

Der Vortrag belegte den 2. Platz beim Wettbewerb um den Heinz-Gerngroß-Förderpreis 2023 der Deutschen Gesellschaft für Wehrmedizin und Wehrpharmazie e. V.