Einsatz gegen Corona: Serologische Untersuchungen als Tool zur Aufrechterhaltung der Einsatzbereitschaft der Bundeswehr in pandemischen Zeiten

Fight against Corona: Serological Testing as a Tool for Maintaining Operational Readiness of the ­Bundeswehr in Pandemic Times

Philipp Girl ^a,b#, Katharina Müller ^a,b#

^a Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr, München

^bDeutsches Zentrum für Infektionsforschung (DZIF), Standort München

^# Gemeinsame Autorenschaft zu gleichen Teilen

Zusammenfassung

Seit dem ersten Auftreten von SARS-CoV-2 beschäftigt das Virus die Weltgemeinschaft, Deutschland und nicht zuletzt die Bundeswehr in hohem Maße. Insbesondere die Aufrechterhaltung der Einsatzbereitschaft unter pandemischen Bedingungen ist hierbei von essenzieller Bedeutung. In diesem Kontext spielt die mikrobiologische Diagnostik eine zentrale Rolle. Neben dem Erkennen von akuten Infektionen mittels Polymerase-Ketten-Reaktion können serologische Verfahren im Anschluss an die Infektion Auskunft geben über das Reaktionsvermögen des individuellen Immunsystems. Daraus lassen sich Daten ableiten, beispielsweise über die Effizienz von Impfungen oder über einen potenziellen Schutz vor (Re-) Infektion nach Genesung oder Immunisierung. Serologische Untersuchungen sind deshalb wichtiger Bestandteil des Pandemiemanagements.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden in insgesamt vier Teilprojekten die Immunreaktion nach Infektion und Impfung evaluiert sowie verschiedene serologische Tests und Verfahren beurteilt. Sämtliche gewonnenen Ergebnisse und Erkenntnisse wurden anschließend in Bezug auf ihren möglichen Einsatz und Nutzen in der Bundeswehr bewertet. Ein eigens entwickelter SARS-CoV-2-Neutralisationstest diente dabei bei allen Untersuchungen als Goldstandard-Methode zur Bestimmung der neutralisierenden Antikörper in Serum- oder Plasmaproben.

Im Teilprojekt I konnte unter anderem gezeigt werden, dass sich die Kreuzreaktivität neutralisierender Antikörper in Abhängigkeit verschiedener besorgniserregender Virusvarianten signifikant unterscheidet und Virusvarianten teilweise nur noch unzureichend bis gar nicht mehr neutralisiert werden. Dies beeinträchtigt den Nutzen therapeutischen Plasmas sowie monoklonaler Antikörper in der Therapie schwerer SARS-CoV-2 Infektionen und erfordert auf der einen Seite eine gute Charakterisierung von Rekonvaleszentenplasmen sowie eine engmaschige Überwachung der Variantenentstehung. Im Teilprojekt II konnte gezeigt werden, dass gewisse Surrogat-ELISA bei bestimmten Fragestellungen als Alternativmethode zum Neutralisationstest in Betracht kommen. Damit können mehr Labore der Bundeswehr zum Nachweis neutralisierender Antikörper befähigt werden, da kein spezielles Sicherheitslabor der Stufe 3 nötig ist, um solche ELISA durchzuführen. Im Teilprojekt III konnte gezeigt werden, dass eine Corona-Schutzimpfung signifikant höhere Neutralisationstiter bewirkt als eine natürliche Infektion und damit maßgeblich zur Gesunderhaltung der Soldatinnen und Soldaten beiträgt. Des Weiteren fand sich, dass bestimmte Surrogat-ELISA und sogar einer von zwei getesteten Schnelltests unter bestimmten Voraussetzungen genutzt werden können, um den Impferfolg beispielsweise im Rahmen der Einsatzvorbereitung zu überprüfen. Zuletzt wurden im Teilprojekt IV drei quantitative ELISA-Systeme zur Bestimmung der Antikörpermenge evaluiert. Hierbei zeigte sich deutlich, dass trotz der Verwendung eines WHO-Standards bei keinem der Tests eine gute Korrelation zum Neutralisationstest vorliegt. Somit kann zum jetzigen Zeitpunkt keiner der Tests als Alternativmethode zum Goldstandard eingesetzt werden. Die Quantifizierung neutralisierender Antikörper obliegt deshalb weiterhin Speziallaboren der Schutzstufe 3, die Neutralisationstests durchführen können.

Schlüsselwörter: SARS-CoV-2, COVID-19, Serologie, Neutralisationstest, Antikörper, Virusvarianten, Einsatzbereitschaft

Summary

Since the first appearance of SARS-CoV-2, the virus has been of great concern to the global community, Germany and not least, the Bundeswehr. In particular, maintaining operational readiness under pandemic conditions is essential. In this context, diagnostic microbiology plays a key role. In addition to the detection of acute infections by polymerase chain reaction (PCR), serological tests can provide information about the responsiveness of the individual immune system after infection. From this, data can be derived, for example, on the efficiency of vaccinations or on potential protection against (re-)infection after recovery or immunization. Serological testing is therefore an important component of pandemic management.

Within the scope of this work, the immune response after infection and vaccination was evaluated in a total of four subprojects, and various serological tests and procedures were assessed. All results and findings obtained were then evaluated in terms of their possible use and benefit in the Bundeswehr. A specially developed SARS-CoV-2 neutralization assay served as the gold standard method for determining neutralizing antibodies in serum or plasma samples. In subproject I it could be shown, among other things, that the cross-reactivity of neutralizing antibodies differs significantly depending on different virus variants of concern (VOC) and that variants are partially only insufficiently neutralized or not neutralized at all. This affects the usefulness of therapeutic plasma and monoclonal antibodies in the therapy of severe SARS-CoV-2 infections and requires, on the one hand, a good characterization of convalescent plasmas as well as close monitoring of the development of VOCs. In subproject II it was shown that certain surrogate ELISAs can be considered as an alternative method to the neutralization assay for certain questions. Thus, more Bundeswehr laboratories can be enabled to detect neutralizing antibodies, since no biosafety level 3 laboratory is required to perform such ELISAs. In subproject III, it could be shown that a vaccination against corona leads to significantly higher neutralization titers than a natural infection and thus contributes significantly to the health maintenance of soldiers. Furthermore, it was shown that certain surrogate ELISA and even one of two evaluated rapid tests can be used under certain conditions to check vaccination success, for example, in the context of mission preparation. Finally, three quantitative ELISA systems for the determination of antibody levels were evaluated in subproject IV. It became clear that despite the use of a WHO standard, none of the tests had a good correlation with the results from the neutralization assay. Thus, none of the tests can be used as an alternative method to the gold standard at this time. The quantification of neutralizing antibodies therefore remains the responsibility of specialized biosafety level 3 laboratories that can carry out neutralization assays.

Keywords: SARS-CoV-2, COVID-19, serology, neutralization test, antibodies, virus variants, operational readiness

Einleitung

Seit dem ersten Auftreten von SARS-CoV-2 beschäftigt das Virus die Weltgemeinschaft, Deutschland und nicht zuletzt die Bundeswehr in hohem Maße. Trotz der Implementierung verschiedener Schutzmaßnahmen verbreitete sich SARS-CoV-2 innerhalb kürzester Zeit weltweit und wurde schnell nicht nur zu einer dringenden medizinischen Herausforderung, sondern zu einer ernsten sozio-ökonomischen Belastung [1]. Die Bundeswehr unterstützte in vielen Bereichen und war in den letzten beiden Jahren eng in verschiedene Maßnahmen der Bundesregierung eingebunden. Gleichzeitig muss die Bundeswehr aber auch ihren Verpflichtungen im Rahmen der Landes- und Bündnisverteidigung nachkommen. Die Einsatzbereitschaft der Soldatinnen und Soldaten, gerade in pandemischen Zeiten, zu sichern, hat dabei höchste Priorität, weshalb die Erforschung neuartiger Erreger zu einer der Kernkompetenzen des medizinischen B-Schutzes zählt. Während der direkte Erregernachweis mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) die ätiologische und prognostische Bewertung einer Infektion ermöglicht [16], kann der serologische Nachweis SARS-CoV-2-spezifischer Antikörper für ein sehr breites Corona-Monitoring eingesetzt werden.

Antikörper können genutzt werden, um nach Ablauf einer Infektion Aussagen über das Reaktionsvermögen des Immunsystems, die Effizienz einer Impfung oder den potenziellen Schutz vor einer (Re-) Infektion zu treffen. Dabei kann die immunologische Antwort qualitativ wie auch quantitativ beurteilt werden und eignet sich so auch zur Erhebung epidemiologischer Parameter. Gleichzeitig kann die Serologie zwischen einer natürlichen Infektion und Impfantikörpern unterscheiden und somit letztlich auch zur Erfolgskontrolle nach Impfungen eingesetzt werden. Für die Bundeswehr ist die Serologie aufgrund ihres breit gefächerten Anwendungsbereichs ebenfalls ein wichtiges Tool zur Sicherstellung und Erhaltung der Einsatzbereitschaft.

In der vorliegenden Arbeit wurden im Rahmen von vier Teilprojekten Fragestellungen bezüglich der Detektion SARS-CoV-2-spezifischer Antikörper bearbeitet und die Effizienz von Antikörpern bei der Virusneutralisation evaluiert. Als Basis diente ein eigens für diese Untersuchungen entwickelter in-house Neutralisationstest (NT), der bei allen Projekten als Goldstandard für die Detektion und die Quantifizierung SARS-CoV-2 spezifischer Antikörper genutzt wurde. Als funktioneller Test ist der NT dabei in der Lage, hoch spezifische Antikörper mit neutralisierender Wirkung nachzuweisen. Die Bestätigung der neutralisierenden Funktion ist für viele serologische Fragestellungen essenziell, da ausschließlich solche Antiköper in der Lage sind, an Schlüsselstrukturen der Viruspartikel (Spike-Proteine) zu binden und so zu verhindern, dass eine Zelle infiziert werden kann.

Für den Nachweis wird das Wachstum einer SARS-CoV-2-Viruskultur auf einem Zellrasen mit und ohne Zugabe einer seriell verdünnten Patientenprobe evaluiert und so die Abnahme der Infektiosität durch die in der Probe vorhandenen neutralisierenden Antikörper bestimmt. Die letzte noch neutralisierende Verdünnungsstufe wird als Titer (1:XX) angegeben. In Abhängigkeit vom genutzten Virusstamm kann der NT außerdem Auskunft über die Effizienz der Neutralisation verschiedener Virusvarianten geben. Ein Nachteil dieser Methode ist, dass mit vermehrungsfähigem Virus gearbeitet wird, wodurch der NT nur in speziellen Laboren der Biologischen Schutzstufe 3 (BSL3) durchgeführt werden kann, innerhalb der Bundeswehr also lediglich am Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr. Gleichzeitig handelt es sich beim NT um eine sehr zeitaufwändige Methode, die erst nach ca. 72 h Ergebnisse liefert.

Mit dem NT als Goldstandard hat sich die vorliegende Arbeit zunächst mit dem Einfluss diverser Mutationen im Virusgenom auf die Effizienz neutralisierender Antikörper in therapeutischem Plasma beschäftigt (Teilprojekt I). Aufgrund der Beschränkung von NT-Arbeiten auf das BSL3, wurden im nächsten Schritt Surrogate Enzyme-Linked Immunosorbent-Assays hinsichtlich ihrer Eignung als NT-Alternative untersucht, wodurch mehr Labore der Bundeswehr zum Nachweis neutralisierender Antikörper befähigt werden könnten (Teilprojekt II). Mit Einführung der Vakzine wurden im Anschluss verschiedene Testsysteme auf ihre Tauglichkeit untersucht, den Impferfolg bei Soldatinnen und Soldaten zu überprüfen und so die Einsatzkontingente zu schützen (Teilprojekt III). Zuletzt wurde der Nutzen verschiedener quantitativer Testsysteme zur potenziellen Bestimmung des Impfschutzes überprüft und evaluiert (Teilprojekt IV).

Teilprojekt I: Virusvarianten

Im ersten Teilprojekt wurde mittels NT die Neutralisationsaktivität von wildtyp-spezifischen Antikörpern gegen zwei Virusvarianten, Alpha (B.1.1.7) und Beta (B.1.351), vergleichend untersucht, die beide durch die WHO als besorgniserregend eingestuft wurden [19][20]. Die zahlreichen Mutationen werfen dabei die Frage auf, inwieweit Antikörper, die gegen eine bestimmte SARS-CoV-2-Variante gerichtet sind, überhaupt noch in der Lage sind, andere Varianten effektiv zu neutralisieren oder ob solche Mutationen zu einem so genannten „Immunescape“ führen, bei dem das Virus durch die Antikörper schlechter oder sogar gar nicht mehr erkannt wird. Dies ist insbesondere für die Verwendung von therapeutischen Plasmen wichtig, wie es in den Bundeswehrkrankenhäusern sowie vielen zivilen Gesundheitseinrichtungen häufig zur Behandlung schwerer SARS-CoV-2-Infektionen verwendet wird. Dabei handelt es sich um Plasma von erkrankten und wieder vollständig genesenen Patienten. Aufgrund der häufig sehr schnellen Ausbreitung von neuen Varianten ist allerdings in vielen Fällen davon auszugehen, dass die Spender mit einer anderen Variante infiziert waren als der Patient, dem das Plasma letztendlich verabreicht wird [3].

Untersucht wurden insgesamt 98 (Alpha) bzw. 89 (Beta) Proben von Patienten, die zu Beginn der Pandemie (also vor Auftreten beider Virusvarianten) eine klinisch manifeste SARS-CoV-2-Infektion durchgemacht und anschließend therapeutisches Plasma gespendet hatten.

Der direkte Titer Vergleich zeigte dabei eine Reduktion der Neutralisationsfähigkeit bei allen Proben gegen Alpha. Lediglich 4 Proben konnten ihre Neutralisierungsfähigkeit vollständig beibehalten. Bei 16 Serumproben hingegen konnte keine Wirkung mehr gegen Alpha nachgewiesen werden, obwohl diese Seren in parallel durchgeführten Tests weiterhin in der Lage waren, Wildtyp-Virus zu neutralisieren. Alle 20 Proben, die initial negativ auf neutralisierende Antikörper gegen MUC-IMB-1 getestet worden waren, zeigten erwartungsgemäß auch gegen Alpha keine Aktivität. Eine einzelne Probe zeigte eine um 20 % erhöhte Neutralisierungsfähigkeit gegen Alpha (Abbildung 1A).

Außerdem wurde untersucht, wie gut die Titer der einzelnen Proben gegen Wildtyp und Alpha korrelieren: mit r = 0,86 lag zwar eine mittlere Korrelation vor; da die Titer-Veränderungen jedoch sehr variabel waren, konnten auf der Grundlage des Titers gegen Wildtyp keine Vorhersagen über die neutralisierende Aktivität gegen Alpha getroffen werden.

Gegen Beta war der Neutralisationsverlust noch deutlicher, wobei die Aktivität im Mittel um 99 % abnahm und ein Großteil der untersuchten Proben Beta überhaupt nicht mehr neutralisieren konnte. Lediglich bei neun Proben konnte eine Restaktivität nachgewiesen werden, wobei auch hier eine signifikante mittlere Reduktion um 91,5 % vorlag (Abbildung 1B). Die Pearson-Regressionsanalyse zeigte lediglich eine geringgradige Korrelation (r = 0,53; 95 % CI: 0,37 0,67) zwischen dem Titer gegen Wildtyp im Vergleich zu Beta, sodass auch hier keine Rückschlüsse von einem auf den anderen Titer geschlossen werden konnten.

Abb. 1: Der direkte Vergleich von Wildtyp (jeweils orange) und Alpha (blau, Abbildung 1A) bzw. Beta (violett, Abbildung 1B) zeigt eine deutliche Abnahme der Neutralisationsfähigkeit (Grafik nach MÜLLER et al. [13][14]).

Insgesamt konnte in diesem Teilprojekt gezeigt werden, dass es grundsätzlich eine gewisse Kreuzneutralisation zwischen Antikörpern gegen verschiedene Virusvarianten gibt, wenngleich mit deutlichen Unterschieden und einer teilweise nur noch unzureichenden Neutralisation.

Die Verwendung therapeutischer Plasmen bei Patienten, die mit einer anderen Variante als der Spender infiziert sind, kann sich also unter Umständen trotzdem positiv auswirken, ist aber aufgrund der häufig signifikanten Reduktion in der Neutralisationseffektivität insgesamt als kritisch zu bewerten.

Plasmaspenden sollten idealerweise gegen die wichtigsten aktuell zirkulierenden Virusstämme getestet und nur Patienten verabreicht werden, die mit einem Stamm infiziert sind, der durch das Plasma effizient neutralisiert wird. Im klinischen Alltag, wo dies nicht immer möglich ist, sollte unbedingt therapeutisches Plasma mit möglichst hohen Titern verwendet werden, um die potenzielle Abnahme der neutralisierenden Aktivität auszugleichen.

Teilprojekt II: Surrogat ELISA

Im zweiten Teilprojekt wurden zwei kommerziell erhältliche Surrogat-ELISA, das SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies Detection Kit (von AdipoGen Life Sciences, Liestal, Schweiz) und das cPass™ SARS-CoV-2 Neutralization Antibody Detection Kit (von GenScript Biotech, NJ, USA), im direkten Vergleich mit dem NT getestet, um ihre Sensitivität, Spezifität sowie ihre Eignung als potenzieller NT-Ersatz zu evaluieren.

Surrogat-Tests nutzen die Interaktion der sogenannten Rezeptorbindedomäne (RBD) als Teil des Spike Proteins von SARS-CoV-2 und dem ACE2-Rezeptor menschlicher Zellen. Die Bindung von RBD an ACE2 ermöglicht dem Virus die Infektion einer Zelle, diese Bindung kann aber durch neutralisierende Antikörper verhindert werden.

Da Surrogat-Testsysteme ohne vermehrungsfähiges Virus arbeiten und somit keine Labore der Schutzstufe 3 benötigen, könnten sie schnell, sicher und kostengünstig in jedem Diagnostiklabor (und somit auch im Einsatz) genutzt werden, was sie für die Bundeswehr äußerst interessant macht.

Insgesamt 276 Patientenproben wurden in beiden Surrogat ELISA und dem NT auf neutralisierende Antikörper getestet. 230 davon waren im Vorfeld in einem Screening mittels ELISA positiv auf SARS-CoV-2-Antikörper getestet worden. Beide Surrogat-ELISA waren einfach durchzuführen und hatten einen signifikanten Zeitvorteil ­(Bearbeitungszeit GenScript: 1,5 h; AdipoGen: 2,5 h) gegenüber dem konventionellen NT (72 h). Abbildung 2 zeigt die Ergebnisse beider Tests im direkten Vergleich zum NT-Titer. Der GenScript zeigte eine Sensitivität von 98,7 %, während der AdipoGen mit nur 82,9 % eine deutlich höhere Anzahl falsch negativer Ergebnisse erzielte. Die hohe Sensitivität des GenScript korrelierte jedoch mit einer niedrigeren Spezifität von nur 69,5 %, was wiederum mit einer großen Anzahl falsch positiver Ergebnisse einherging.

Im Vergleich zum GenScript zeigte der AdipoGen eine deutlich höhere Spezifität von 98,3 % mit nur zwei falsch positiven Ergebnissen. Die Sensitivität verbesserte sich generell mit höheren Titerwerten und erreichte 100 % für NT-Titer ≥ 1:40. Gleichzeitig führte eine leichte Erhöhung des Cut-off-Wertes von 20 % auf 30 % zu einer Spezifität von 100 % im AdipoGen sELISA.

Damit erreichte der AdipoGen für diese Proben sowohl eine Sensitivität als auch eine Spezifität von 100 % (Abbildung 2). Ein klarer Nachteil beider Surrogat ELISA ist jedoch, dass aus den Ergebnissen (angegeben als Inhibition in Prozent) keine Rückschlüsse auf den im NT ermittelten Antikörper-Titer gezogen werden können. Insbesondere für die Auswahl von therapeutischem Plasma ist aber eine exakte Bestimmung des Antikörper-­Titers zur Abschätzung des Therapieerfolges unerlässlich.

Abb. 2: Verteilung der von AdipoGen (A) und GenScript (B) ermittelten Inhibitionswerte für NT negative (Titer ≤ 1:5) und positive (Titer ≥ 1:40) Ergebnisse. (Grafik nach MÜLLER et al. [12])

Unsere Ergebnisse zeigen, dass aufgrund der geringeren Sensitivität (AdipoGen) bzw. Spezifität (GenScript) und der fehlenden Korrelation zwischen Inhibitionswerten und Antikörper-Titern derzeit keiner der beiden sELISA den Virusneutralisationstest vollständig ersetzen kann. Trotzdem könnte insbesondere der AdipoGen sELISA in einem zweistufigen Diagnosealgorithmus sinnvoll eingesetzt werden, um die Zahl aufwendiger NTs zu reduzieren.

Teilprojekt III: Impftiter

Mit der Einführung der Impfung im Frühjahr 2021 rückte schnell ein neues Feld in den Fokus der Forschung: die Antikörperantwort nach Immunisierung. Ein wichtiger Aspekt ist dabei die Möglichkeit, schnell und einfach den Impferfolg zu kontrollieren, um gegebenenfalls Impfpläne auch individuell anpassen zu können, sollte es zu keiner adäquaten Immunreaktion kommen.

Zum Zeitpunkt des Teilprojektes wurden in der Bundeswehr sowohl ein vektorbasierter Impfstoff (AstraZeneca) als auch die beiden mRNA-Impfstoffe (Comirnaty^® und Spikevax^®) eingesetzt. Untersucht wurde die Leistungsfähigkeit von vier kommerziell erhältlichen Testsystemen zum schnellen und unkomplizierten Nachweis neutralisierender Antikörper nach Impfung: 2 Schnelltests (Coris BioConcept und Concile InfectCheck) sowie zwei Surrogat-­ELISA (NeutraLisa und AdipoGen), immer im direkten Vergleich zum NT.

Insgesamt wurden 334 Seren getestet, darunter 30 Negativkontrollen, 128 Seren von genesenen, aber ungeimpften Personen sowie 176 Seren von unvollständig (eine Impfung) oder vollständig (zwei Impfungen) geimpften Personen. Zunächst wurde bei der Testung der Proben mittels NT deutlich, dass sich die ermittelten Titerwerte signifikant (p < 0,0001) zwischen genesenen und vollständig geimpften Personen unterschieden: Während der mittlere Titer bei Genesenen bei lediglich 37 lag, war er bei geimpften Personen fast vierfach höher bei durchschnittlich 129 (Abbildung 3). Dies erscheint überraschend, ist aber im Einklang mit einer aktuellen Studie von CAVANAUGH et al., die ebenfalls feststellten, dass eine vollständige Impfung einen signifikant besseren Schutz im Vergleich zu einer durchgemachten natürlichen Infektion bietet [2].

Abb. 3: Titerwerte von zweifach geimpften (links) im Vergleich zu genesenen Patienten (rechts) (Grafik nach GIRL et al. [6]).

Hinsichtlich der Fragestellung, inwieweit die 4 Tests genutzt werden können, um einen Impferfolg zu beurteilten, zeigte sich Folgendes: Die Sensitivität der Schnelltests war sehr unterschiedlich und betrug 71,6 % für den Coris BioConcept und 98,4 % für den Concile InfectCheck. Im Gegensatz dazu betrug die Sensitivität bei den Surrogat-ELISA 86 % für den NeutraLISA und 98 % für den AdipoGen. Alle Tests zeigten die höchste Empfindlichkeit bei der Untersuchung von Proben von vollständig geimpften Personen, wobei beide Surrogat-ELISA sogar eine Sensitivität von 100 % erreichten. Die Gesamtspezifität betrug 89,3 % für den Coris BioConcept und lediglich 58,3 % für den Concile InfectCheck.

Ähnlich deutliche Unterschiede konnten zwischen den beiden Surrogat-ELISA festgestellt werden, wobei die Gesamtspezifität bei 82,1 % für den NeutraLISA und nur 54,8 % für den AdipoGen lag. Alle Tests zeigten wiederum eine Spezifität von 100 % beim Testen der negativen Kontrollproben, wobei die Spezifität am niedrigsten war, wenn Proben von unvollständig geimpften Personen untersucht wurden. Ähnliche Ergebnisse wurden bei NT-negativen Proben von Genesenen beobachtet. Diese Diskrepanz könnte auch auf die Tatsache zurückzuführen sein, dass unser NT sehr konservativ ausgelegt ist, um so spezifisch wie möglich zu sein, was eine gewisse Einschränkung mit sich bringt und dazu führen könnte, dass die Spezifität der vier evaluierten Tests unterschätzt wird. Eine andere mögliche Erklärung für diese Diskrepanz könnte auch das Vorhandensein spezifischer Antiköper ohne neutralisierende Funktion sein. Solche nicht-neutralisierenden Antikörper werden durch den NT nicht erkannt, können aber ELISA sowie den Schnelltests kreuzreagieren und zu falsch positiven Ergebnissen führen.

Unsere Untersuchungen zeigen, dass sich insbesondere beide Surrogat-ELISA durchaus als alternative Testmethoden für die Bestimmung neutralisierender Antikörper nach Impfung eignen, wenn NT-Tests nicht verfügbar sind. Innerhalb der Bundeswehr könnten solche Untersuchungen problemlos in den diagnostischen Laboren der Bundeswehrkrankenhäuser, beispielsweise im Rahmen der Einsatzvorbereitung, vorgenommen werden. Es muss jedoch angemerkt werden, dass alle Tests für die Untersuchung von Patientenkohorten mit einer erwartbar niedrigen Immunantwort (z. B. Patienten unter B-Zell-Depletionstherapie, onkologische Patienten, usw.) ungeeignet zu sein scheinen, da hier ein hohes Risiko falsch positiver Ergebnisse besteht.

Teilprojekt IV: Quantifizierung

Im weiteren Verlauf der Pandemie stellte die Weltgesundheitsorganisation (WHO) dann einen internationalen Standard (ISO) für SARS-CoV-2-Immunglobuline vor, anhand dessen Testergebnisse in International Units (IU) oder Binding Antibody Units (BAU) angegeben werden können. Damit sollte eine bessere Vergleichbarkeit der Ergebnisse sowohl zwischen verschiedenen Tests als auch zwischen Untersuchungslaboren erreicht werden [9][15]. Eine solche Vergleichbarkeit ist insbesondere wichtig, um in Zukunft Grenzwerte für den Immunschutz definieren und Empfehlungen bezüglich (Auffrisch-) Impfungen geben zu können [4]. Verschiedene Hersteller haben diesen Standard implementiert und Testsysteme auf den Markt gebracht, die nicht nur universell miteinander vergleichbar sein, sondern auch eine Quantifizierung von Antikörpern ermöglichen sollten.

Um die Leistungsfähigkeit solcher Tests und ihren potenziellen Nutzen für die Bundeswehr zu untersuchen, haben wir im Rahmen des letzten Teilprojektes drei kommerziell vertriebene ELISA-Kits für die Quantifizierung evaluiert: den QuantiVac ELISA von Euroimmun, den SERION ELISA agile vom Institut Virion Serion sowie den COVID-19 quantitative ELISA von DeMediTec. Nach Angaben der Hersteller sind alle drei Tests gegen den internationalen Standard der WHO kalibriert, Tabelle 1 gibt eine Übersicht über die Charakteristika der drei ELISA.

Insgesamt wurden 50 Serumproben von vollständig geimpften Personen im Doppelansatz und gemäß den Anweisungen der Hersteller unter Verwendung einer 10-fach seriellen Verdünnung (beginnend bei 1:101) getestet. Im Anschluss wurden die Ergebnisse aller drei Tests evaluiert und auf die angestrebte Vergleichbarkeit hin untersucht sowie mit den Ergebnissen des NT als Goldstandardmethode zur Quantifizierung verglichen.

Es zeigten sich signifikante Unterschiede (p < 0,0001) in der Menge der mit den einzelnen Tests nachgewiesenen Antikörper. Auffallend war, dass der DeMediTec fast durchgängig die höchsten Werte lieferte mit einem Spitzenwert von 16755 IU/ml (Median 5587 IU/ml; 95 %-CI 5223–7423). Die anderen beiden Tests hingegen lieferten deutlich niedrigere Ergebnisse mit einem Maximum von 5250 BAU/ml beim agile (Median 1140 IU/ml; 95 %-CI 1173–1868) bzw. 6810,2 BAU/ml beim QuantiVac. Nichtsdestotrotz fanden alle 3 Tests die jeweils höchste und niedrigste Antikörpermenge im identischen Probensatz. Zudem war die Probe mit der niedrigsten gemessenen Antiköpermenge auch die Probe mit dem niedrigsten NT-Titer. Die Übereinstimmung der einzelnen Messungen der übrigen Proben war jedoch bestenfalls mäßig. Die höchste Korrelation wurde zwischen dem QuantiVac und dem DeMediTec-Test beobachtet (Spearman r = 0,51, p < 0,0002). Eine ähnliche Korrelation wurde auch zwischen dem DeMediTec und dem agile (Spearman r = 0,45, p = 0,0009) beobachtet, während keine signifikante Korrelation zwischen dem QuantiVac und dem agile festgestellt werden konnte (Spearman r = 0,01, p = 0,9).

 

Tab. 1: Herstellerangaben: RU = Relative Units, AU = Arbitrary Units, BAU = Binding Antibody Units, IU = International Units; ¹rekombinant hergestellt basierend auf Wuhan-Hu-1, ²ganzes S-Protein, ³ganzes S-Protein als Trimer (Tabelle nach GIRL et al. [5])

Zusätzlich wurden die Ergebnisse der einzelnen ELISA mit den NT-Ergebnissen verglichen, wo sich grundsätzlich eine positive Korrelation für alle 3 Tests zeigte (Abbildung 4). Die Korrelationen unterschieden sich jedoch deutlich und waren schwach für den QuantiVac (r = 0,35, p = 0,01) und den agile (r = 0,46, p = 0,0007) und mittel bis gut für den DeMediTec (r = 0,71, p < 0,0001).

Abb. 4: Verteilung der ELISA Ergebnisse im direkten Vergleich mit den NT-Titern. Die Übereinstimmung zwischen QuantiVac und NT (A) bzw. agile und NT (B) war mittelmäßig bis gut, während sie zwischen DeMediTec und NT (C) gut war. Die hervorgehobenen Bereiche zeigen beispielhafte Proben mit signifikant unterschiedlichen NT-Titern trotz sehr ähnlicher ELISA-Ergebnisse (Grafik nach GIRL et al. [5]).

Insgesamt könnte die durch die WHO beschriebene Antigenspezifität die Vergleichbarkeit zwischen ELISA, die häufig auf ähnlichen aber nicht immer identischen Antigenen basieren, erschweren. Dennoch stellte eine vorangegangene Studie eine starke Harmonisierung bei Verwendung des Standards fest, trotz unterschiedlicher Zielantigene [18]. Alle drei hier getesteten ELISA weisen Antikörper der Klasse IgG nach und verwenden das Spike-Protein oder Teile davon als Antigen. Während der QuantiVac die S1-Untereinheit des Spike-Protein nutzt, wird im agile das gesamt Spike als Antigen verwendet, was erklären könnte, warum beide Tests keine signifikante Übereinstimmung zeigen. Diese Theorie wird auch dadurch unterstützt, dass wir eine bessere Übereinstimmung zwischen dem agile und dem DeMediTec feststellen konnten, der ebenfalls das gesamte Spike als Antigen verwendet.

Bei der Betrachtung der Einzelergebnisse wird deutlich, dass von der gemessenen Antikörpermenge nicht auf den NT-Titer geschlossen werden kann und umgekehrt, was in Abbildung 4 noch einmal grafisch durch die gelb hervorgehobenen Bereiche verdeutlicht wird.

Insgesamt ist die Übereinstimmung der Ergebnisse zwischen allen drei ELISA trotz Kalibrierung gegen den WHO Standard hochgradig variabel, was sich mit anderen Studien deckt, die ähnliche Testsysteme von anderen Herstellern untersucht haben [7][8][10][11][17]. Daher muss die Interpretation der Ergebnisse weiterhin individuell durch das durchführende Labor auf den jeweiligen Patienten zugeschnitten sein. Noch wichtiger ist allerdings die Erkenntnis, dass keiner der drei getesteten ELISA in ihrer derzeitigen Form den Neutralisationstest ersetzen kann, sodass die Quantifizierung weiterhin Speziallaboren vorbehalten bleiben muss.

Fazit

In 4 Teilprojekten konnte dargelegt werden, dass die Serologie eine wichtige Rolle im Corona-Monitoring und der Pandemiebekämpfung spielt und einen wesentlichen Beitrag zur Aufrechterhaltung der Einsatzbereitschaft sowie zur Gesunderhaltung der Soldatinnen und Soldaten leisten kann. Es konnte gezeigt werden, dass vereinfachte Testsysteme zur Detektion neutralisierender Antikörper unter bestimmten Umständen geeignet sind, um Diagnostiklabore und Sanitätsversorgungszentren auch ohne Speziallabor zu befähigen, Impferfolge bei Soldatinnen und Soldaten zu kontrollieren und damit erheblich zum Schutz der Kontingente beitragen. Es konnte außerdem die Wichtigkeit der vollständigen Impfung zur Bildung einer robusten Immunantwort gezeigt werden. Gleichzeitig demonstrieren die Ergebnisse eindrucksvoll, dass die Entstehung von SARS-CoV-2-Varianten weiterhin herausfordernd ist und deshalb engmaschig kontrolliert werden muss. Ferner führen die Mutationen im Erbgut dazu, dass serologische Methoden kontinuierlich überprüft und gegebenenfalls angepasst werden müssen. Auf Basis all dieser Ergebnisse konnte die vorliegende Arbeit zeigen, dass die Serologie ein wichtiges Tool der mikrobiologischen Diagnostik mit vielen Anwendungsmöglichkeiten darstellt und einen wichtigen Beitrag zur Aufrechterhaltung der Einsatzbereitschaft, insbesondere unter pandemischen Bedingungen, leisten kann.

Abschließend möchten wir die Gelegenheit nutzen, um uns bei allen zu bedanken, die an der Entstehung dieser Arbeit beteiligt waren, insbesondere bei unserem hervorragenden technischen Personal für die Durchführung der vielen Untersuchungen und Experimente im Labor.

Die Arbeit wurde mit dem Paul-Schürmann-Preis 2022 der Deutschen Gesellschaft für Wehrmedizin und Wehrpharmazie e.V. ausgezeichnet.

Literatur

1. Ali I, Alharbi OML: COVID-19: Disease, management, treatment, and social impact. Science of The Total Environment 2020; 728: 138861. mehr lesen
2. Cavanaugh AM, Spicer KB, Thoroughman D, Glick C, Winter K: Reduced Risk of Reinfection with SARS-CoV-2 After COVID-19 Vaccination - Kentucky, May-June 2021. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2021; 70(32): 1081–1083. mehr lesen
3. Colson P, Devaux CA, Lagier J-C, Gautret P, Raoult D: A Possible Role of Remdesivir and Plasma Therapy in the Selective Sweep and Emergence of New SARS-CoV-2 Variants. Journal of Clinical Medicine 2021; 10(15): 3276. mehr lesen
4. Feng S, Phillips DJ, White T et al.: Correlates of protection against symptomatic and asymptomatic SARS-CoV-2 infection. Nat Med 2021; 27(11): 2032–2040. mehr lesen
5. Girl P, Mantel S, von Buttlar H, Wölfel R, Müller K: Side-By-Side Evaluation of Three Commercial ELISAs for the Quantification of SARS-CoV-2 IgG Antibodies. Viruses 2022; 14(3): 577. mehr lesen
6. Girl P, Zwirglmaier K, von Buttlar H, Wölfel R, Müller K: Evaluation of two rapid lateral flow tests and two surrogate ELISAs for the detection of SARS-CoV-2 specific neutralizing antibodies. SSRN Journal 2021;, letzter Aufruf 20. November 2022. mehr lesen
7. Higgins V, Fabros A, Kulasingam V: Quantitative Measurement of Anti-SARS-CoV-2 Antibodies: Analytical and Clinical Evaluation. Journal of Clinical Microbiology 2021; 59(4): , letzter Aufruf 20. November 2022. mehr lesen
8. Kim Y, Lee JH, Ko GY et al.: Quantitative SARS-CoV-2 Spike Antibody Response in COVID-19 Patients Using Three Fully Automated Immunoassays and a Surrogate Virus Neutralization Test. Diagnostics (Basel) 2021; 11(8): 1496. mehr lesen
9. Knezevic I, Mattiuzzo G, Page M, Minor P, Griffiths E, Nuebling M, Moorthy V: WHO International Standard for evaluation of the antibody response to COVID-19 vaccines: call for urgent action by the scientific community. The Lancet Microbe 2022; 3(3): e235–e240. mehr lesen
10. Lukaszuk K, Kiewisz J, Rozanska K et al.: Usefulness of IVD Kits for the Assessment of SARS-CoV-2 Antibodies to Evaluate the Humoral Response to Vaccination. Vaccines 2021; 9(8): 840. mehr lesen
11. Mendrone-Junior A, Dinardo CL, Ferreira SC et al.: Correlation between SARS-COV-2 antibody screening by immunoassay and neutralizing antibody testing. Transfusion 2021; 61(4): 1181–1190. mehr lesen
12. Müller K, Girl P, von Buttlar H, Dobler G, Wölfel R: Comparison of Two Commercial Surrogate Elisas to Detect a Neutralizing Antibody Response to SARS-CoV-2. SSRN Electronic Journal 2020; , letzter Aufruf 20. November 2022. mehr lesen
13. Müller K, Girl P, Giebl A, von Buttlar H, Dobler G, Bugert JJ, Gruetzner S, Wölfel R. Emerging SARS-CoV-2 variant B.1.1.7 reduces neutralisation activity of antibodies against wild-type SARS-CoV-2. Journal of Clinical Virology 2021; 142: 104912. mehr lesen
14. Müller K, Girl P, Giebl A, Gruetzner S, Antwerpen M, Khatamzas E, Wölfel R, von Buttlar H: Sensitivity of two SARS-CoV-2 variants with spike protein mutations to neutralising antibodies. Virus Genes 2021; 57(6): 502–509. mehr lesen
15. National Institute for Biological Standards and Control: First WHO International Standard for anti-SARS-CoV-2 immunoglobulin (human); NIBSC code: 20/136; Instructions for use (Version 2.0, Dated 17/12/2020). 2020; , letzter Aufruf 20. November 2022. mehr lesen
16. Oude Munnink BB, Worp N, Nieuwenhuijse DF, Sikkema RS, Haagmans B, Fouchier RAM, Koopmans M: The next phase of SARS-CoV-2 surveillance: real-time molecular epidemiology. Nat Med 2021; 27(9): 1518–1524. mehr lesen
17. Perkmann T, Perkmann-Nagele N, Koller T et al.: Anti-Spike Protein Assays to Determine SARS-CoV-2 Antibody Levels: a Head-to-Head Comparison of Five Quantitative Assays. Microbiol Spectr 2021; 9(1): e0024271. mehr lesen
18. Van Elslande J, Decru B, Jonckheere S et al.: Antibody response against SARS-CoV-2 spike protein and nucleoprotein evaluated by four automated immunoassays and three ELISAs. Clin Microbiol Infect 2020; 26(11): 1557.e1-1557.e7 mehr lesen
19. World Health Organization (WHO): Tracking SARS-CoV-2 variants. , letzter Aufruf 20. November 2022 mehr lesen
20. World Health Organization (WHO):. Weekly epidemiological update on COVID-19 - 11 May 2021. , letzter Aufruf 20. November 2022. mehr lesen

Manuskriptdaten

Zitierweise

Girl P, Müller K: Einsatz gegen Corona: Serologische Untersuchungen als Tool zur Aufrechterhaltung der Einsatzbereitschaft der Bundeswehr in pandemischen Zeiten. WMM 2023; 67(1-2): 27-34.

DOI: https://doi.org/10.48701/opus4-60

Verfasser

Oberstabsveterinär Dr. Philipp Girl

Oberstabsveterinär Dr. Katharina Müller

Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr

Neuherbergstr. 11, 80937 München

E-Mail: philippgirl@bundeswehr.org
katharina5mueller@bundeswehr.org

Manuscript data

Citation

Girl P, Müller K: [Fight against Corona: Serological testing as a Tool for Maintaining Operational Readiness of the Bundeswehr in Pandemic Times]. WMM 2023; 67(1-2): 27-34.

DOI: https://doi.org/10.48701/opus4-60

Authors

Major (VC) Dr. Philipp Girl

Major (VC) Dr. Katharina Müller

Bundeswehr Institute of microbiology

Neuherbergstr. 11, 80937 München

E-Mail: philippgirl@bundeswehr.org
katharina5mueller@bundeswehr.org