Patch-Clamp-Technologie: Effizientes Substanzscreening zur Verbesserung der Patientenversorgung bei Organophosphatintoxikationen

Patch-Clamp-Technology: Efficient substance screening to improve patient care in cases of ­organophosphate poisoning

Lara Maria Molitor^a, Dirk Steinritz^a und Thomas Seeger^a

^a Institut für Pharmakologie und Toxikologie der Bundeswehr

Zusammenfassung

Organophosphatintoxikationen sind nach wie vor eine ernsthafte toxikologische Gefährdung. Durch die irreversible Hemmung der Acetylcholinesterase (AChE) führen diese zu einer Überstimulation und Desensitisierung der nikotinischen Acetylcholinrezeptoren (nAChR). Bestehende Therapieansätze sind in ihrer Wirksamkeit begrenzt, wodurch die Entwicklung neuer Strategien zur Wiederherstellung der Rezeptorfunktion an Bedeutung gewinnt.

Die vorliegende Arbeit beschreibt die Möglichkeiten der Patch-Clamp-Technologie als präzise Methode zur funktionellen Untersuchung ligandengesteuerter Ionenkanäle. Mithilfe dieses automatisierten Patch-Clamp-Systems wurden exemplarische Messungen an Zellen mit humanen nAChR-α7- und GABA_A-Rezeptoren durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen typische Rezeptorantworten, einschließlich der positiv allosterischen Modulation des nAChR-α7 durch PNU-120596 sowie der hemmenden Wirkung von Picrotoxin am GABA_A-Rezeptor. Diese Beispiele verdeutlichen die Eignung der Methode zur qualitativen und quantitativen Bewertung substanzspezifischer Effekte in pharmakologischen und toxikologischen Kontexten.

Die Patch-Clamp-Technologie ist eine tierversuchsfreie und effiziente Methode zur Charakterisierung neuroaktiver Substanzen und zur Unterstützung der Wirkstoffentwicklung bei neurotoxikologischen Fragestellungen hervorragend geeignet.

Schlüsselwörter: Organophosphatintoxikation, nikotinischer Acetylcholinrezeptor, GABA_A-Rezeptor, Patch-Clamp-Technologie, neurotoxikologische Wirkstoffforschung

Summary

Organophosphate intoxications continue to represent a serious toxicological challenge, as they cause overstimulation and desensitization of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) through irreversible inhibition of acetylcholinesterase (AChE). Existing therapeutic approaches are limited in their efficacy, emphasizing the need for novel strategies to restore receptor function.

This study highlights the applicability of the patch-clamp technique as a precise tool for the functional assessment of ligand-gated ion channels. Using an automated patch-clamp system, exemplary recordings were ­performed on cells expressing human nAChR-α7 and ­GABA_A receptors. The results illustrate characteristic receptor responses, including positive allosteric modulation of nAChR-α7 by PNU-120596 and inhibition of GABA_A receptor activity by picrotoxin. These examples demonstrate the method’s capacity to evaluate compound-specific effects in both pharmacological and toxicological applications quantitatively.

The patch-clamp technique is an efficient and animal-­free approach for studying neuroactive compounds and supporting early-stage drug development in the field of neurotoxicology.

Keywords: organophosphate intoxication; nicotinic acetylcholine receptor; GABA_A receptor; patch-clamp-technique; neurotoxic drug research

Einleitung und wehrmedizinische Relevanz

Organophosphatintoxikationen sind weiterhin eine erhebliche Bedrohung. Vergiftungen können in einigen Fällen nicht ausreichend therapiert werden, da die bis heute verfügbaren Antidote nicht ausreichend wirksam sind. Organophosphate hemmen die Acetylcholinesterase (AChE) irreversibel [8]. Durch die Akkumulation von Acetylcholin (ACh) im synaptischen Spalt führt eine Überstimulation cholinerger Rezeptoren zu einer sogenannten cholinergen Krise. Klinisch äußert sich diese in Krampfanfällen, Atemlähmung und schließlich im Tod, sofern keine adäquate Behandlung erfolgt [1].

Die derzeitige Standardtherapie kombiniert die Gabe des Parasympatholytikums Atropin mit einem Oxim (z. B. Obidoxim) zur Reaktivierung der gehemmten AChE [8]. Diese Behandlung zeigt jedoch nur eine begrenzte Wirksamkeit, insbesondere bei Intoxikationen mit bestimmten Nervenkampfstoffen wie Soman oder Tabun. Bei diesen Substanzen tritt nach kurzer Zeit eine sog. Alterung (Dealkylierung mit Konformationsänderung) des Enzyms ein, die eine Reaktivierung nahezu unmöglich macht [7]. Daraus ergibt sich ein dringender Bedarf an neuen therapeutischen Strategien, die unabhängig von der Wiederherstellung der AChE-Aktivität sind [5].

Ein zentraler pathophysiologischer Aspekt bei Organophosphatintoxikationen ist die anhaltende Dysfunktion der nAChR. Abbildung 1 zeigt schematisch den Ablauf der nAChR-Aktivierung und Desensitisierung. nAChR spielen eine entscheidende Rolle in der neuromuskulären Signalübertragung, und ihre Desensitisierung trägt wesentlich zur persistierenden Muskelschwäche und Ateminsuffizienz nach einer Intoxikation bei [1]. Aktuelle Forschungsansätze konzentrieren sich daher zunehmend auf die Identifizierung und Charakterisierung von Substanzen, die die Funktion der nAChR modulieren oder wiederherstellen können [5].

Abb. 1: Schematische Darstellung der Aktivierung und Desensibilisierung nikotinischer Acetylcholinrezeptoren. Die Anzahl der desensibilisierten Rezeptoren steigt mit höheren Acetylcholin-Konzentrationen. In Gegenwart von Soman oder Tabun ist eine Reaktivierung mit derzeitigen Therapeutika nicht möglich. (Grafik erstellt mit BioRender.com)

Zur Untersuchung solcher Substanzeffekte auf molekularer Ebene sind elektrophysiologische Methoden von besonderer Bedeutung. Die Patch-Clamp-Technologie ermöglicht die direkte Messung von Ionenströmen und liefert dadurch direkte Rückschlüsse auf den funktionellen Zustand der Rezeptoren unter dem Einfluss pharmakologisch aktiver oder toxischer Substanzen [2]. Aufgrund ihrer Vielseitigkeit eignet sich die Methode für eine Vielzahl unterschiedlicher Fragestellungen, die tierversuchsfrei untersucht werden können. Die Kombination aus zellbasiertem Screening und computergestützter Wirkstoffentwicklung ermöglicht es, neue Wirkstoff­kandidaten frühzeitig und effizient zu identifizieren [6].

Neben ihrer Anwendung zum Screening rezeptoraktiver Substanzen, die eine Resensitisierung des nAChR nach Nervenkampfstoffexposition bewirken könnten, bietet die Methode auch großes Potenzial für die Untersuchung weiterer toxikologisch relevanter Fragestellungen, zum Beispiel die Charakterisierung der neurotoxischen Wirkung von unbekannten chemischen Substanzen. Insbesondere ihre Wirkung an nAChR und GABA_A-Rezeptoren ist hier von Interesse. Darüber hinaus kann die Patch-Clamp-Technologie auch wertvolle Beiträge zur Aufklärung der molekularen Toxikologie von Hautkampfstoffen liefern, wie etwa zum Verständnis der Wirkung von S-Lost auf TRP-Kanäle und zur Erforschung möglicher therapeutischer Interventionen.

Material und Methoden

Für die elektrophysiologischen Untersuchungen wurden zwei stabil transfizierte Zelllinien verwendet. Als Modellsystem des humanen nikotinischen Acetylcholinrezeptors α7 (hnAChR- α7) dienten GH4C1-Zellen (Rattenhypophysenzellen), die stabil mit der cDNA des hnAChR- α7 transfiziert waren (Genionics, Schweiz). Für die Untersuchungen am humanen GABA_A-Rezeptor α₁β₃γ₂ (hGABA_A-α₁β₃γ₂) wurden HEK-293-Zellen (humane embryonale Nierenzellen) verwendet, die eine stabile Expression der entsprechenden humanen Rezeptoruntereinheiten aufweisen (Charles River, USA).

Die Whole-Cell-Patch-Clamp-Messungen wurden mittels eines automatisierten Patch-Clamp-Systems (Patchliner Octo, Nanion Technologies) durchgeführt. Zwei HEKA EPC10 Quadro-Verstärker ermöglichten dabei simultane Ableitungen an bis zu acht Kanälen. Zellernte und Messprotokolle wurden gemäß den Herstellerangaben durchgeführt [4].

Für beide Zelllinien wurden Einzelzellmessungen unter standardisierten Bedingungen durchgeführt. Die Ableitungen der GH4C1 hnAChR- α7-Zellen erfolgten bei einem Haltepotenzial von –75 mV unter Verwendung von NPC-16-Borosilikat-Chips mit hohem Widerstand (3–5 MΩ; 071101, Nanion Technologies). Die verwendeten Pufferlösungen wurden von Nanion Technologies bezogen (Externe Lösung 083001, interne CsF-Lösung 083008 und Seal-Lösung 083012). Zur Aktivierung der Rezeptoren wurden 100 µM Nikotin oder ACh für 175 ms appliziert, gefolgt von einem direkten Auswaschen mit 200 µL externer Lösung.

Die Messungen an HEK-293 hGABA_A- α₁β₃γ₂-Zellen wurden bei einem Haltepotenzial von –80 mV mit NPC-16-Borosilikat-Chips mittleren Widerstands (1,8–3 MΩ; 071001, Nanion Technologies) durchgeführt. Hierbei kamen die externe Lösung 083001, interne KF-Lösung 083007 und Seal-Lösung 083012 (Nanion Technologies) zum Einsatz, wobei die externe Lösung mit 5 mM Na-ATP angereichert wurde. Die Rezeptoren wurden durch die Applikation von 100 µM GABA für 500 ms aktiviert; anschließend erfolgte ein Auswaschen mit 100 µL externer Lösung. Die zu prüfenden Substanzen wurden in den angegebenen Konzentrationen gemeinsam mit den jeweiligen Agonisten nach der initialen Aktivierung appliziert. Alle Lösungen wurden unmittelbar vor den Experimenten frisch hergestellt.

Ergebnisse

Die Effekte der getesteten Substanzen wurden anhand des Vergleichs mit der initialen Rezeptoraktivierung der jeweiligen Zelle bewertet. Abbildung 2 zeigt exemplarisch unterschiedliche Modulationstypen, wie sie mithilfe der automatisierten Patch-Clamp-Technologie erfasst werden können.

Abb. 2: Beispiele möglicher Substanzeinflüsse und deren Bewertung mittels automatisierter Patch-Clamp-Messungen:
a) Beispiel einer positiv allosterischen Modulation am hnAChR- α7. Die Wirkung von 100 μM Nikotin (dunkelblau) wird durch Co-Applikation von 10 μM PNU-120596 (grün) verstärkt.
b) Beispiel einer antagonistischen Wirkung am hGABAA- α1β3γ2. Die durch 100 µM GABA (dunkelblau) ausgelöste Aktivierung wird in Anwesenheit von 10 µM Picrotoxin (grün) gehemmt; auch nachfolgende Applikationen von GABA zeigen eine anhaltend reduzierte Aktivität.
c) Beispiel einer konzentrationsabhängigen Wirkung. 100 µM Picrotoxin zeigen eine verstärkte inhibitorische Wirkung im Vergleich zu 10 µM Picrotoxin (b). Die Applikationsdauer wird jeweils durch die schwarze horizontale Linie am oberen Bildrand dargestellt.

PNU-120596 (1-(5-Chlor-2,4-dimethoxyphenyl)-3-(5-methylisoxazol-3-yl)harnstoff) wurde als Referenzsubstanz zur Darstellung einer positiv allosterischen Modulation am hα7-nAChR eingesetzt [3]. Die initiale, durch 100 µM Nikotin ausgelöste, Aktivierung wurde in Anwesenheit von 10 µM PNU-120596 verstärkt. Wie in Abbildung 2a gezeigt, führte die Co-Applikation zu einem erhöhten maximalen Ionenstrom sowie zu einer verlängerten Öffnungsdauer der Kanäle.

Der antagonistische Einfluss wurde exemplarisch am hGABA_A- α₁β₃γ₂ demonstriert. Der nichtkompetitive GABA_A-Rezeptorantagonist Picrotoxin reduzierte die durch 100 µM GABA ausgelöste Stromantwort bereits bei Co-Applikation einer Konzentration von 10 µM (Abbildung 2b). Nachfolgende Applikationen des Agonisten zeigten keine vollständige Wiederherstellung der Aktivität, was auf eine anhaltende Hemmung hindeutet. Eine Erhöhung der Picrotoxin-Konzentration auf 100 µM führte zu einer noch stärkeren Inhibition des Initialstroms (Abbildung 2c) und dient hier als Beispiel für eine konzentrationsabhängige Wirkung.

Neben der qualitativen Beschreibung der Modulationseffekte ermöglichen die Messungen auch eine quantitative Auswertung. Dazu können beispielsweise die Peakmaxima oder die Fläche unter der Kurve (AUC) der gemessenen Stromantworten herangezogen werden. Nach Normalisierung an die jeweilige Initialaktivierung der Zellen lassen sich die relativen Effekte verschiedener Konzentrationen direkt vergleichen. So zeigten die Rezeptoren nach Applikation von 10 µM Picrotoxin im Mittel noch eine Restaktivität von etwa 30 %, während bei 100 µM Picrotoxin nur noch rund 11 % der Ausgangsaktivität festgestellt wurden (n = 5–6). Die Daten beziehen sich jeweils auf die fünfte Applikation und beschreiben somit den anhaltend inhibitorischen Effekt nach der versuchten Reaktivierung mit dem Agonisten.

Abbildung 3 zeigt exemplarisch den Versuchsablauf zur Untersuchung potenzieller Therapeutika bei Organophosphat-induzierter Desensitisierung nikotinischer Acetylcholinrezeptoren.

 

 Abb. 3: Beispielhafter Ablauf einer Messreihe zum Substanzscreening potenzieller Therapeutika zur Reaktivierung des nAChR:
In der ersten Applikation werden die Rezeptoren durch 100 µM Acetylcholin (ACh) initial aktiviert. Anschließend erfolgt eine Desensitisierung der Rezeptoren durch Exposition mit einer hohen Agonistenkonzentration (10 mM ACh). Die obere Reihe der drei folgenden Applikationen dient als Kontrolle und zeigt, dass nach Desensitisierung keine Reaktivierung durch 100 µM ACh erfolgt. In der unteren Reihe wird die mögliche Resensitisierung am Beispiel von PNU-120596 dargestellt: Durch Co-Applikation von 100 µM ACh mit 10 bzw. 100 µM PNU-120596 kann trotz vorheriger Desensitisierung eine deutliche Aktivierung der Rezeptoren beobachtet werden. In der abschließenden Applikation ohne PNU-120596 zeigt sich noch eine geringe spontane Reaktivierung.

Zur Modellierung der durch Organophosphate hervorgerufenen Rezeptordesensitisierung wurden die hα7-nAChR-Zellen nach einer initialen Aktivierung mit 100 µM ACh einer hohen Agonistenkonzentration (in diesem Beispiel 10 mM ACh) ausgesetzt. Nach dieser Desensitisierungsphase blieben die Rezeptoren bei anschließender Applikation der Standardkonzentration über den Messzeitraum hinweg inaktiv. Die Dauer und Intensität der Desensitisierung können experimentell durch Variation der Agonistenkonzentration weiter untersucht werden. Als Beispiel für eine mögliche Wiederherstellung der Rezeptoraktivität wurde der positiv allosterische Modulator PNU-120596 verwendet. Durch die Co-Applikation von PNU-120596 mit ACh konnte trotz vorausgegangener Desensitisierung eine erneute Aktivierung der Rezeptoren erzielt werden. In Abwesenheit des Modulators wurde anschließend lediglich eine geringe Restaktivität beobachtet.

Zur quantitativen Bewertung potenzieller Therapeutika werden die Stromantworten aller Applikationen einer Zelle auf die initiale Aktivierung normiert. Die Fähigkeit zur Reaktivierung der Rezeptoren kann anschließend prozentual erfasst und zwischen verschiedenen Substanzen oder Konzentrationen verglichen werden.

Diskussion und Fazit

Die automatisierte Patch-Clamp-Technologie ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur funktionellen Charakterisierung ligandengesteuerter Ionenkanäle [2]. Durch die standardisierte Messung der Rezeptoraktivität lassen sich agonistische, antagonistische und allosterisch modulierende Effekte zuverlässig erfassen. Am Beispiel des hα7-nAChR und des hGABA_A- α₁β₃γ₂ Rezeptors konnte demonstriert werden, dass die Methode sowohl aktivierende als auch hemmende Wirkmechanismen differenziert abbilden kann.

Besonders im Zusammenhang mit Organophosphatintoxikationen eignet sich die Methode hervorragend, um neue Wirkstoffe zu identifizieren. Die Rezeptordysfunktionalität infolge der irreversiblen AChE-Hemmung stellt ein wesentliches therapeutisches Problem bei Vergiftungen dar. Die in dieser Arbeit beispielhaft gezeigte Reaktivierung des hα7-nAChR durch den positiv allosterischen Modulator PNU-120596 verdeutlicht das Potenzial der Patch-Clamp-Technologie, um neue potenzielle Therapeutika zur Wiederherstellung gestörter Rezeptorfunktionen zu identifizieren [3].

Zusammengefasst liefert die Methode einen entscheidenden Beitrag zum Verständnis der molekularen Mechanismen der Organophosphatintoxikationen und eröffnet neue Perspektiven für die präklinische Entwicklung von Therapeutika. Durch die Kombination mit computergestützten Ansätzen kann das Screening potenzieller Wirkstoffe gezielter und nachhaltiger gestaltet werden, wodurch die Patch-Clamp-Technologie langfristig eine Schlüsselrolle in der translationalen Neuro- und Toxikologieforschung einnehmen kann. Auch die Analyse ­neurotoxischer Mechanismen oder die Abschätzung potenzieller Nebenwirkungen ist möglich. Der Einsatz automatisierter Plattformen gewährleistet eine hohe Reproduzierbarkeit und Datendichte, was die Patch-Clamp-Technologie zu einem effizienten und tierversuchsfreien Screening-Tool in der modernen Wirkstoffentwicklung macht.

Kernaussagen

• Die Patch-Clamp-Technologie ermöglicht die direkte Analyse substanzspezifischer Effekte an ligandengesteuerten Ionenkanälen.
• Automatisierte Patch-Clamp-Systeme erlauben effiziente, tierversuchsfreie Untersuchungen pharmakologisch und toxikologisch relevanter Substanzen.
• Substanzeinflüsse auf Rezeptoraktivität und Signalstärke können qualitativ und quantitativ bewertet werden.
• Die Methode erlaubt die Nachbildung der Desensitisierungsproblematik bei Organophosphatintoxikation und das Screening potenzieller Therapeutika.
• Die Methode bietet ein wertvolles Screening-Tool für die frühe Wirkstoffentwicklung bei neurotoxikologischen Fragestellungen.

Literatur

1. Aroniadou-Anderjaska V, Figueiredo TH, Araujo Furtado M de, Pidoplichko VI, Braga MFM. Mechanisms of Organophosphate Toxicity and the Role of Acetylcholinesterase Inhibition. Toxics 2023;11(10):866. mehr lesen
2. Dunlop J, Bowlby M, Peri R, Vasilyev D, Arias R. High-throughput electrophysiology: an emerging paradigm for ion-channel screening and physiology. Nat Rev Drug Discov 2008;7(4):358–368. mehr lesen
3. Hurst RS, Hajós M, Raggenbass M, Wall TM, Higdon NR, Lawson JA et al. A novel positive allosteric modulator of the alpha7 neuronal nicotinic acetylcholine receptor: in vitro and in vivo characterization. J Neurosci 2005;25(17):4396–4405. mehr lesen
4. Obergrussberger A, Friis S, Brüggemann A, Fertig N. Automated patch clamp in drug discovery: major breakthroughs and innovation in the last decade. Expert Opin Drug Discov 2021;16(1):1–5. mehr lesen
5. Scheffel C, Niessen KV, Rappenglück S, Wanner KT, Thiermann H, Worek F et al. Counteracting desensitization of human α7-nicotinic acetylcholine receptors with bispyridinium compounds as an approach against organophosphorus poisoning. Toxicol Lett 2018;293:149–56. mehr lesen
6. Scheffel C, Niessen KV, Rappenglück S, Wanner KT, Thiermann H, Worek F et al. Electrophysiological investigation of the effect of structurally different bispyridinium non-oxime compounds on human α7-nicotinic acetylcholine receptor activity-An in vitro structure-activity analysis. Toxicol Lett 2018;293:157–166. mehr lesen
7. Sirin GS, Zhou Y, Lior-Hoffmann L, Wang S, Zhang Y. Aging mechanism of soman inhibited acetylcholinesterase. J Phys Chem B 2012; 16(40):12199–12207. mehr lesen
8. Worek F, Thiermann H, Wille T. Organophosphorus compounds and oximes: a critical review. Arch Toxicol 2020;94(7):2275–2292. mehr lesen

Manuskriptdaten

Zitierweise

Molitor LM, Steinritz D, Seeger T. Patch-Clamp-Technologie.:Effizientes Substanzscreening zur Verbesserung der Patientenversorgung bei Organophosphatintoxikationen. WMM 2026;70(1–2):58-62.

DOI: https://doi.org/10.48701/opus4-809

Für die Verfasser

Leutnant (SanOA) Lara Molitor

Institut für Pharmakologie und Toxikologie der Bundeswehr

Neuherbergstr. 11, 80937 München

E-Mail: laramolitor@bundeswehr.org

Als Poster beim 56. Jahreskongress der Deutschen Gesellschaft für Wehrmedizin und Wehrpharmazie e. V. am 31. Oktober 2025 in Papenburg präsentiert und mit dem 3. Preis ausgezeichnet.

Manuscript Data

Citation

Molitor LM, Steinritz D, Seeger T. [Patch-Clamp-Technology: Efficient substance screening to improve patient care in cases of organophosphate poisoning]. WMM 2026;70(1–2):58-62.

DOI: https://doi.org/10.48701/opus4-809

For the Authors

Lieutenant (SanOA) Lara Molitor

Bundeswehr Institute of Pharmacology and Toxicology

Neuherbergstr. 11, D-80937 Munich

E-Mail: laramolitor@bundeswehr.org

Presented as a poster at the 56th Annual Congress of the German Society for Military Medicine and Military Pharmacy on October 31, 2025, in Papenburg/Germany, and awarded third prize.