LiBOD™ – Liquid Biopsy bei Organschäden:
Vergleichende Analyse marktverfügbarer Messverfahren im Hinblick auf den Einsatz in der Landes- und Bündnisverteidigung¹

LiBOD™ - Liquid Biopsy in Organ Damage: Comparative Analysis of Commercially Available Measurement Methods Focused on Use in National and Alliance Defense

Paula Müller^a,b, Aliona Wöhler^b, Bernd Giebel^c, Tobias Tertel^c, Robert Schwab^b, Arnulf G. Willms^b,
Miroslaw T. Kornek^a,b

¹ Die in dieser Publikation verwendeten Personenbezeichnungen beziehen sich immer gleichermaßen auf weibliche und männliche Personen. Auf eine Doppelnennung und gegenderte Bezeichnungen wird zugunsten einer besseren Lesbarkeit verzichtet.

^a Institut für molekulare Medizin und experimentelle Immunologie, Universitätsklinikum Bonn

^b Klinik für Allgemein-, Viszeral- und Thoraxchirurgie, Bundeswehrzentralkrankenhaus Koblenz

^c Institut für Transfusionsmedizin, Universitätsklinikum Essen

Zusammenfassung

Das Polytrauma zählt im Rahmen kriegerischer Auseinandersetzungen, insbesondere in Szenarien der Landes- und Bündnisverteidigung, zu den häufigsten und komplexesten Verletzungsmustern. Für eine zielgerichtete Triage und die frühzeitige Einleitung adäquater Therapieentscheidungen sind belastbare, blutbasierte Biomarker von hoher Relevanz. Diese sollen eine schnelle Einschätzung des Schweregrades sowie des Risikos einer Organbeteiligung ermöglichen, bevor bildgebende Verfahren verfügbar sind.

Extrazelluläre Vesikel (EVs), insbesondere small extracellular vesicles (sEVs), werden von nahezu allen Zelltypen freigesetzt und spiegeln den physiologischen oder pathophysiologischen Zustand ihrer Ursprungszellen wider, da sie zelltyp- und zustandsspezifische molekulare Signaturen tragen. Unmittelbar nach einer Gewebeschädigung unterscheiden sich daher Zusammensetzung und Fracht der freigesetzten EVs deutlich von denen unter gesunden Bedingungen. Frühere Arbeiten im Rahmen des LiBOD™ (Liquid Biopsy in Organ Damage) Projekts konnten zeigen, dass ein Organ Damage (OD) nach Polytrauma mit einer verstärkten Freisetzung monozytärer EVs, insbesondere CD14⁺ sEVs und deren CD9⁺/CD14⁺-doppelpositiven Subpopulation, assoziiert ist. Ungeklärt war bislang, welche analytische Plattform diese Befunde reproduzierbar abbilden kann und gleichzeitig eine hohe Standardisierung, Bedienerfreundlichkeit und Verfügbarkeit aufweist, um perspektivisch zu einem feldtauglichen Demonstrator/Point-of-Care-Gerät weiterentwickelt zu werden.

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war daher der direkte Vergleich marktverfügbarer Technologien zur Bestimmung von sEVs in Serumproben von Polytrauma-Patienten. Untersucht wurden fünf Messsysteme: die SP-IRIS-basierte Single-Particle-Analytik (ExoView™ R100), die bead-basierte Durchflusszytometrie (BD FACSCanto™ II), die faseroptische Surface-Plasmon-Resonanz-Analyse (FO-SPR, White FOX) sowie zwei free-floating-basierte Ansätze für small und large EVs. Primär analysierte Marker waren CD14 und die Doppelpositivität CD9⁺/CD14⁺. Die Ergebnisse sollen eine Entscheidungsgrundlage für die Auswahl der geeignetsten Plattform für zukünftige militärmedizinische Anwendungen liefern.

Schlüsselwörter: Polytrauma, extrazelluläre Vesikel, liquid biopsy, Point-of-Care, Einsatzmedizin, Triage

Summary

Polytrauma represents one of the most frequent and complex injury patterns, particularly in military conflict settings such as National and Alliance Defense (LV/BV) scenarios. For accurate triage and the timely initiation of appropriate treatment, early blood-based biomarkers are of critical importance, as they can provide a rapid assessment of injury severity and the risk of internal organ involvement, even before imaging diagnostics are available.

Extracellular vesicles (EVs), especially small extracellular vesicles (sEVs), are released by virtually all cell types and reflect the physiological or pathophysiological state of their cells of origin, carrying cell type- and condition-specific molecular signatures. Consequently, immediately after tissue injury, the composition and load of released EVs differ markedly from those under healthy conditions. Previous research within the LiBOD™ (Liquid Biopsy in Organ Damage) project has shown that organ damage (OD) following polytrauma is associated with an increased release of monocyte-derived EVs, specifically CD14⁺ sEVs and their CD9⁺/CD14⁺ double-positive subpopulation.

Until now, it remained unclear which analytical platform can reliably reproduce these findings while offering standardization, user-friendliness, and field applicability suitable for future development into a portable point-of-care device.

The present study therefore compared several commercially available technologies for the detection of sEVs in serum samples from polytrauma patients. Five measurement systems were evaluated: SP-IRIS-based single-particle analysis (ExoView™ R100), bead-based flow cytometry (BD FACSCanto™ II), fiber-optic surface plasmon resonance analysis (FO-SPR, White FOX), and two free-floating approaches for small and large EVs. The primary markers analyzed were CD14 and the double-positive population CD9⁺/CD14⁺. The results provide a basis for selecting the most suitable analytical platform for future military medical applications.

Keywords: polytrauma; extracellular vesicles; liquid biopsy; point-of-care; military medicine; triage

Einleitung und Hintergrund

Verletzungen im Rahmen von Polytraumata können auf unterschiedliche Mechanismen zurückgeführt werden: Ein penetrierendes Trauma kann infolge von Splitter- oder Sprengexplosionen entstehen, stumpfe Verletzungsmuster können durch die Druckwelle einer Detonation verursacht werden, und ein Dezelerationstrauma tritt vermehrt nach abrupten Geschwindigkeitsänderungen auf, etwa beim Zusammenstoß eines Fahrzeugs mit einem Hindernis [2]. Insbesondere im militärischen Akutsetting dominieren Explosions- und ballistische Verletzungen, häufig in Form kombinierter Mischtraumata mit stumpfen und penetrierenden Komponenten.

Die Arbeitsgruppe um Owens et al. untersuchte die Verletzungsmuster während der Operation Iraqi Freedom und der Operation Enduring Freedom und zeigte, dass bis zu 78 % der erlittenen Kriegsverletzungen Explosionsverletzungen waren. In der Mehrzahl der Fälle führten unkontrollierbare Blutungen zum Tod [1][3]. Vor diesem Hintergrund erscheint die Entwicklung eines sensitiven Risiko- und Prognoseparameters – eines Biomarkers im Serum – für die wehrmedizinische Versorgung von besonderem Wert. Extrazelluläre Vesikel (EVs) stellen aus biologischer Sicht vielversprechende Kandidaten für eine Frühprognose dar, da sie als Teil der unmittelbaren Stressantwort nach Trauma freigesetzt werden und inflammatorische Signalwege widerspiegeln [5–7].

Die aktuellen Empfehlungen der International Society for Extracellular Vesicles (ISEV) betonen die Bedeutung einer multimodalen Charakterisierung von EVs [4]. Zugleich bestehen zwischen den verfügbaren Messplattformen deutliche Unterschiede hinsichtlich Sensitivität, Spezifität und Reproduzierbarkeit, was die Auswahl eines praxistauglichen Ansatzes erschwert [7]. Die durchgeführten Vorarbeiten im Polytrauma-Kontext zeigten, dass Monozyten-assoziierte sEV-Signaturen mit der Verletzungsschwere und der Organbeteiligung korrelieren [5][6].

Neben der Leber ist die Milz insbesondere als häufig betroffenes parenchymatöses Organ von hoher klinischer Relevanz. Weitere aktuelle Ergebnisse aus dem LiBOD™-Projekt konnten zeigen, dass monozytenabgeleitete sEVs (CD9⁺/CD14⁺ sEVs) nicht nur zur Erfassung einer Organbeteiligung im Rahmen des Polytraumas geeignet sind, sondern darüber hinaus eine Korrelation zur Schwere der erlittenen Verletzung, z. B. des Milztraumas aufweisen [7]. Diese Korrelation mit dem AAST-Score unterstreicht das Potenzial sEV-basierter Biomarker. Gerade im militärmedizinischen Kontext, etwa bei limitierter Verfügbarkeit schnittbildgebender Verfahren im Feld, könnte die Integration solcher sEV-Marker in bestehende diagnostische Algorithmen, wie z. B. die erweiterte FAST-Sonographie (E-FAST), zu einer verbesserten Risikostratifizierung und Triage beitragen. Unklar blieb jedoch, welche quantitative Methodik für die Akut- oder Feldmedizin geeignet ist.

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, einen marktverfügbaren Technologieträger zu identifizieren, der eine verlässliche Diskriminierung zwischen Polytrauma-Patienten mit und ohne Organ Damage (OD, d. h. mit bzw. ohne Verletzungen innerer Organe) ermöglicht – bei gleichzeitig praktikablem Zeitbedarf für den klinischen oder einsatznahen Einsatz.

Material und Methoden

Kohorte und Ethik

In die Studie wurden am Bundeswehrzentralkrankenhaus Koblenz behandelte polytraumatisierte Patienten mit einem Injury Severity Score (ISS) ≥ 16 eingeschlossen. Die Kohorte wurde in zwei Gruppen unterteilt: Patienten mit klinisch bestätigten führenden Verletzungen parenchymatöser Organe (Organ Damage (OD); z. B. Leber-, Milz- oder Lungenverletzungen) sowie Patienten ohne Organbeteiligung (w/o OD), bei denen vorwiegend muskuloskelettale und weichteilbetonte Verletzungsmuster vorlagen. Beide Gruppen erfüllten die Kriterien eines Polytraumas; Alter und Geschlecht wurden zwischen den Gruppen gematcht. Erfasst wurden darüber hinaus klinische Basisparameter wie ASA-Score, C-reaktives Protein (CRP), Fibrinogen, die Behandlungsdauer auf der Intensivstation sowie die prä- und posttraumatische Medikation. Ausschlusskriterien waren fehlende Einwilligung, bestehende maligne oder chronisch-entzündliche Erkrankungen sowie ein Alter unter 18 Jahren. Die Studie wurde nach den Grundsätzen der Deklaration von Helsinki durchgeführt und von der Ethikkommission der Landesärztekammer Rheinland-Pfalz genehmigt (Votum Nr. 2020–15050).

Präanalytik

Die Blutentnahmen erfolgten in der Akutphase innerhalb von 24 Stunden nach dem Trauma. Nach der Serumgewinnung wurden die Proben aliquotiert, bei −80 °C gelagert und auf Trockeneis transportiert, um eine standardisierte Handhabung zu gewährleisten.

Isolation

Die Anreicherung der sEVs erfolgte mittels Size-Exclusion-Chromatographie (SEC). Für die Analytik wurden die vorderen vier Fraktionen herangezogen, die den höchsten Anteil an sEVs aufweisen, während die späteren Fraktionen zunehmend lipoproteinreich ausgefallen sind [5].

Charakterisierung

Zur methodischen Absicherung wurde ein Western Blot durchgeführt, bei dem typische sEV-assoziierte Markerproteine (CD9, CD63, CD81, TSG101, ALIX) sowie Negativmarker für zelluläre Kontaminationen (Calreticulin) analysiert wurden. Damit konnte die sEV-Zuordnung gemäß den Kriterien der MISEV 2018-Guidelines bestätigt werden [4][5].

Messplattformen und Marker

Fünf verschiedene, marktverfügbare Plattformen wurden hinsichtlich ihrer Eignung zur quantitativen Bestimmung von CD14-assoziierten small EVs verglichen:

1. SP-IRIS Single-Particle Analysis (ExoViewTM R100, Unchained Labs, Boston, USA): Capture Antikörper-beschichtete Chips (anti-CD9, anti-CD63 und anti-CD81) zur Immobilisierung von sEVs; Analyse auf Einzelpartikelebene. Neben Einzelfärbungen (nur CD14⁺) wurde eine Analyse auf CD9⁺/CD14⁺-Events durchgeführt, hierbei wurden ausschließlich sEVs quantifiziert, die auf CD9-Spots immobilisiert und gleichzeitig CD14-positiv waren.
2. Bead-basiertes FACS (BD FACS Canto II, Franklin Lakes, USA): Bindung der sEVs an Latex-Beads und Detektion als Ensemble-Fluoreszenzsignal. Aufgrund methodischer Limitationen ist hier nur eine Einzelfärbung gegen CD14⁺ möglich.
3. Faseroptische Surface-Plasmon-Resonanz-Analyse (FO-SPR; White FOX, VixenBio, Gent, Belgium): Label-freies, immobilisierendes Verfahren auf Basis der faseroptischen Oberflächenplasmonen-Resonanz.; das Sensorsignal entsteht durch Änderungen der refraktiven Indexschicht an der Chipoberfläche beim Binden der EVs. Analysiert wurde eine CD9⁺/CD14⁺-Signatur. Die Methode ermöglicht kurze Laufzeiten (< 80 min ohne SEC, < 60 min möglich).
4. Imaging Flow Cytometry (ImageStreamX Mark II, Luminex, Fremont, USA): Free-floating-Erfassung einzelner Partikel mit bildgebender Validierung; die quantitative Kennzahl basierte auf der Anzahl CD14⁺ Objekte pro ml.
5. Durchflusszytometrie large EVs (MACSQuant 10, Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany): Free-floating-Analyse großer EVs mit simultaner Färbung auf AnnexinV und CD14; berechnet wurde das Verhältnis der CD14⁺/AnnexinV⁺-Events pro 1000 AnnexinV-positiven Signalen. Diese Daten stammen aus einer früheren eigenen Publikation mit Fokus auf large EVs [6].

Primäre Endpunkte

Primärer Endpunkt war der Nachweis signifikanter Unterschiede der CD14-assoziierten sEV-Signatur zwischen der OD- und w/o OD-Gruppe sowie deren Bestätigung in der Doppelpositivität CD9⁺/CD14⁺.

Statistische Analyse

Die Datenauswertung erfolgte mit Prism 10 (GraphPad Software, Boston, USA) und Python 3.12 (Python Software Foundation, Wilmington, USA) in Google Colab Pro (Alphabet Inc., Mountain View, USA). Vor allen Gruppenvergleichen wurde die Normalverteilung der Variablen geprüft (Shapiro – Wilk- und Kolmogorov – Smirnov-Test). Bei gegebener Normalverteilung wurde ein zweiseitiger t-Test mit Welch-Korrektur angewendet. Für kategoriale Variablen, insbesondere Medikationsdaten (z. B. ASS, DOAK, Tranexamsäure), wurde der Fisher’s Exact Test verwendet.

Ergebnisse

Für die Analyse wurden ausschließlich Proben berücksichtigt, die auf mindestens vier der fünf verfügbaren Plattformen erfolgreich gemessen werden konnten („high-confidence cohort“), um die methodische Vergleichbarkeit sicherzustellen.

Plattformvergleich

Alle Systeme zeigten eine höhere Konzentration von CD14⁺ oder CD9⁺CD14⁺ small EVs in der OD-Gruppe (Abbildung 1). Die SP-IRIS-basierte Einzelpartikelanalyse (ExoViewTM R100) erzielte die größte Trennschärfe zwischen OD und w/o OD (unabhängiger t-Test mit Welch-Korrektur, CD14⁺: p = 0,001 und CD9⁺/CD14⁺: p = 0,002). Die FO-SPR-Analyse (White FOX) reproduzierte den Trend mit signifikanter Differenzierung zwischen OD und w/o OD (p = 0,02) bei deutlich kürzerer Laufzeit (< 80 min ohne SEC, < 60 min möglich).

Abb. 1: Vergleichende Analyse CD14-assoziierter small und large extracellular vesicles (EVs) zwischen Patienten mit Organ Damage (OD) und ohne Organ Damage (w/o OD): Dargestellt sind die Ergebnisse der plattformübergreifenden Quantifizierung monozytenabgeleiteter EV-Subpopulationen aus Serumproben polytraumatisch verletzter Patienten. Untersucht wurden CD14⁺- und CD9⁺/CD14⁺-Signaturen unter Nutzung verschiedener Technologien: SP-IRIS-basierte Single-Particle-Analytik (ExoViewTM R100), bead-basierte Durchflusszytometrie (BD FACS Canto II), interferometrische Nanoshift-Analyse (White FOX), Imaging Flow Cytometry (ImageStreamX) sowie die Durchflusszytometrie großer EVs (MACSQuant 10). Die Balken stellen Median-, Quartils- und Streuungswerte der jeweiligen Plattform dar. Der Vergleich zwischen OD- und w/o OD-Gruppe erfolgte mittels unabhängigen t-Test mit Welch-Korrektur (zweiseitig, α = 0,05). Die dargestellten p-Werte geben die Signifikanzniveaus der beobachteten Gruppenunterschiede an. Fallzahlen (n) sind unterhalb der jeweiligen Diagramme angegeben.

Die bead-basierte Durchflusszytometrie (BD FACS Canto II) bestätigte auch die Differenzierung zwischen OD und w/o OD, zeigte jedoch eine geringere Signalamplitude infolge der bead-basierten Messung, in der eine unbekannte Anzahl von sEVs an den Beads bindet und anschließend mit dem anti-CD14 APC spezifisch für CD14 gefärbt wird (p = 0,006). Imaging Flow Cytometry (ImageStreamX) visualisierte CD14⁺ EVs im free-floating-Modus, wies jedoch eine höhere Streuung auf (p = 0,03). Die Durchflusszytometrie großer EVs (MACSQuant 10) zeigte eine analoge Signifikanz für AnnexinV⁺CD14⁺-EVs (p = 0,003).

Diskrimination OD vs. w/o OD

Die AUROC-Werte lagen plattformabhängig zwischen 0,87 (FOX) und 1,0 (ExoViewTM) bei Sensitivitäten von 81–100 % und Spezifitäten von 72–100 %.

Konsens der Plattformen

Über alle Systeme hinweg zeigte sich konsistent eine höhere CD14-assoziierte EV-Signatur bei Patienten mit Organ Damage. Immobilisierende Verfahren (SP-IRIS, FOX, Bead-FACS) erzielten die höchste Trennschärfe, während free-floating-basierte Ansätze (ImageStreamX, MACSQuant10) den biologischen Effekt reproduzierten, jedoch methodenbedingt variabler waren.

Praktische Bewertung

ExoViewTM R100 bot die höchste analytische Präzision, während White FOX durch kurze Laufzeiten und einfachere Handhabung als potenzieller Technologieträger für ein feldtaugliches LiBOD™-System erscheint.

Diskussion und Schlussfolgerung

Die Ergebnisse dieser Arbeit bestätigen die Relevanz monozytenabgeleiteter sEVs als Frühmarker im Kontext des Polytraumas. Sowohl CD14⁺ als auch CD9⁺/CD14⁺ sEVs zeigten konsistent höhere Konzentrationen in Patienten mit Verletzungen der inneren Organe (OD) im Vergleich zur Kontrollgruppe mit Verletzungen des knöchernen Skeletts (w/o OD). Dieser Befund spiegelt eine frühe Immunaktivierung wider, die sich unmittelbar nach dem Trauma in der Zusammensetzung der zirkulierenden Vesikel abbildet [4–6]. Die Einbindung des Tetraspanins CD9 in die Signatur erhöhte die Trennschärfe und spricht dafür, dass ein kontextualisiertes Marker-Profil biologisch aussagekräftiger ist als Einzelfärbungen.

Plattformübergreifend zeigte sich eine hohe Reproduzierbarkeit der Ergebnisse: Immobilisierende Systeme wie SP-IRIS (ExoView™ R100) und FO-SPR-Analysen (White FOX) lieferten die präzisesten Trennungen, während free-floating-Ansätze wie Imaging Flow Cytometry (ImageStreamX) oder klassische Durchflusszytometrie (BD FACS Canto II) größere Streuungen aufwiesen, jedoch denselben biologischen Trend bestätigten. Diese Übereinstimmung über mehrere Technologien hinweg unterstreicht die Robustheit des CD14-Signals und bestätigt die Eignung von sEV-basierten Biomarkern für den klinischen und translationalen Einsatz [5–7].

Besonders in der taktischen Notfallmedizin ergibt sich hieraus ein praxisrelevanter Ausblick. In realen Einsatzszenarien, etwa in Vorfeldgefechtsräumen wie derzeit in der Ukraine, sind Evakuierungen häufig nur unter hohem Risiko oder mit erheblicher Verzögerung möglich. Unter solchen Bedingungen könnte ein hochmobil einsetzbares LiBOD™-System die medizinische Lagebeurteilung entscheidend verbessern. Durch drohnengestützte Transportprozesse ließe sich die Blutprobe bereits während des Transports gegebenenfalls vorbereiten. Dies würde ermöglichen, Triage- und Therapieentscheidungen deutlich früher und datengestützt zu treffen, noch bevor der Patient eine Sanitätseinrichtung erreicht.

Die Kombination aus biologischer Aussagekraft, Automatisierungspotenzial und Mobilität macht das LiBOD™-Konzept zu einem innovativen Ansatz, der die Lücke zwischen der diagnostischen Erfassung und der einsatznahen Entscheidungsunterstützung schließen kann. ­Perspektivisch könnten portable EV-Analysemodule zu ­einem festen Bestandteil der sanitätsdienstlichen Infrastruktur werden – von der vorderen Linie bis zur Role 2. Die hier gewonnenen Erkenntnisse liefern dafür eine belastbare wissenschaftliche Grundlage und markieren einen wichtigen Schritt hin zu einer feldtauglichen, molekular gestützten Triage im militärischen Kontext.

Literaturverzeichnis

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7. Wohler A, Wang B, Schwab R, Lukacs-Kornek V, Willms AG, Kornek MT. Liquid biopsy in organ damage: introduction of an innovative tool for assessing the complexity of blunt splenic injury. Eur J Med Res. 2025;30(1):6. mehr lesen

Danksagung

Wir bedanken uns bei VixenBio (Gent, Belgien) für die fachkundige Durchführung der White-FOX-Messungen und die konstruktive Zusammenarbeit im Rahmen des LiBOD™-Projektes. Die erhobenen Daten wurden unabhängig voneinander ausgewertet und haben wesentlich zur Plattformvergleichbarkeit beigetragen.

Manuskriptdaten

Zitierweise

Müller P, Wöhler A, Giebel B, Tertel T, Schwab R, Willms AG, Kornek MT. LiBOD™ - Liquid Biopsy bei Organschäden: Vergleichende Analyse marktverfügbarer Messverfahren im Hinblick auf den Einsatz in der Landes- und Bündnisverteidigung. WMM 2026;70(1–2):30-34.

DOI: https://doi.org/10.48701/opus4-810

Für die Verfasser

Oberstleutnant d. R. Priv.-Doz. Dr. rer. nat. Miroslaw T. Kornek,

Institut für molekulare Medizin und experimentelle Immunologie (IMMEI)

Universität Bonn

BMZ-II, Venusberg Campus 1, 53127 Bonn

E-Mail: miroslawkornek@web.de

Der Beitrag wurde als Vortrag beim Wettbewerb um den Heinz-Gerngroß-Förderpreis 2025 der Deutschen Gesellschaft für Wehrmedizin und Wehrpharmazie e. V. am 31. Oktober 2025 in Papenburg gehalten und mit dem zweiten Preis ausgezeichnet.

Manuscript Data

Citation

Müller P, Wöhler A, Giebel B, Tertel T, Schwab R, Willms AG and Kornek MT. [LiBOD™ - Liquid Biopsy in Organ Damage: Comparative Analysis of Commercially Available Measurement Methods Focused on Use in National and Alliance Defense]. WMM 2026;70(1–2):30-34.

DOI: https://doi.org/10.48701/opus4-810

For the Authors

Lieutenant Colonel (Res) Associate
Prof. Dr. rer. Nat. Miroslaw
T. Kornek

Institute of Molecular Medicine and Experimental Immunology (IMMEI)

University of Bonn

BMZ-II, Venusberg Campus 1, D-53127 Bonn

E-Mail: miroslawkornek@web.de

The article was presented as a lecture in the competition for the Heinz Gerngroß Award 2025 of the German Society for Military Medicine and Military Pharmacy on October 31, 2025, in Papenburg/Germany and was awarded second prize.